靶向P2Y14R抑制宫颈癌细胞与类器官增殖并激活cAMP/PKA/CREB信号通路

《Purinergic Signalling》：Targeting P2Y14R inhibits proliferation of cervical cancer cells and organoids and activates cAMP/PKA/CREB signaling pathway

嘌呤能信号已被广泛认为是肿瘤进展的关键调节因子，然而P2Y14R在宫颈癌中的作用仍不清楚。本研究在体外细胞实验中使用了P2Y14R拮抗剂PPTN；结果显示其显著抑制了细胞增殖并增加了乳酸脱氢酶（LDH）释放。利用宫颈癌类器官模型进一步验证了P2Y14R拮抗作用的抗肿瘤效应。机制上，PPTN处理升高了细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，增强了蛋白激酶A（PKA）和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，从而激活了cAMP/PKA/CREB信号轴。此外，PPTN干预降低了宫颈癌类器官中Ki67的表达，而不影响CK13的表达，表明PPTN的抗肿瘤效应可能并非通过调节分化介导。综上所述，这些发现将P2Y14R鉴定为宫颈癌细胞中cAMP/PKA/CREB信号通路的新型调节因子，为宫颈癌提供了一个有前景的治疗靶点。

研究背景与问题

宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，尤其在发展中国家严重影响女性寿命。每年全球有超过50万女性新确诊宫颈癌，超过30万人死于该病。宫颈癌的发生主要与人乳头瘤病毒（HPV）感染有关，其中HPV-16和HPV-18是最主要的致病亚型，占所有宫颈癌病例的至少70%。早期诊断患者的五年生存率超过90%，但一旦发生复发或远处转移，患者预后显著恶化，生存率大幅下降。因此，寻找有前景的治疗靶点或潜在新药仍是宫颈癌治疗的主要挑战。

近年来，大量证据表明嘌呤能信号已成为多种疾病中有前景的治疗靶点。嘌呤能受体在不同起源的肿瘤细胞、肿瘤浸润炎症细胞和支持性基质细胞中均有表达，使其能够通过多种机制调节肿瘤生长。G蛋白偶联的P2Y受体是嘌呤能受体的重要亚型，在肿瘤中表现出致癌和抑癌的双重作用。关于乳腺癌和前列腺癌的研究表明，P2Y受体通过调节细胞迁移和趋化性增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力，并参与乳腺癌转移微环境的构建。相反，其他研究证明，激活P2Y₁R或P2Y₂R可抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导人结肠癌细胞凋亡。人宫颈癌细胞已被广泛用于研究嘌呤能信号在肿瘤中的作用。P2Y₁₄R广泛参与各种炎症反应和多系统病理过程。激活P2Y₁₄R可减少白细胞介素-6（IL-6）的产生并抑制胶质瘤GL261细胞增殖。P2Y₁₄R被激活后偶联Gi蛋白，抑制腺苷酸环化酶（AC）通路，进而下调细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，触发相应的生物学效应。因此，药理拮抗P2Y₁₄R理论上可增加细胞内cAMP水平。cAMP的主要下游效应分子是蛋白激酶A（PKA），PKA激活后磷酸化多种底物蛋白，包括转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB）。cAMP/PKA/CREB轴在癌症中发挥复杂且依赖于环境的作用，可根据细胞环境和信号动态促进细胞存活或生长停滞。然而，P2Y₁₄R在宫颈癌发生发展中的作用尚不明确，亟需进一步研究。

研究内容与结论

本研究发现，使用P2Y₁₄R拮抗剂PPTN处理与cAMP/PKA/CREB信号轴的激活以及HeLa细胞、SiHa细胞和宫颈癌类器官增殖的减少相关。研究表明，P2Y₁₄R是宫颈癌细胞中cAMP/PKA/CREB信号通路的新型调节因子，为宫颈癌提供了有前景的治疗靶点。

主要关键技术方法

1. 1.
   细胞培养：人宫颈癌细胞系HeLa（HPV 18⁺）和SiHa（HPV 16⁺）购自美国模式培养物保藏中心（ATCC）。
2. 2.
   类器官培养：宫颈癌类器官及相关试剂由杭州艾名医学科技有限公司提供（伦理批准号CTOB-2026-0210）。
3. 3.
   Western blotting：检测PKA、CREB及其磷酸化形式的表达水平。
4. 4.
   酶联免疫吸附测定（ELISA）：检测细胞和类器官裂解液中cAMP浓度。
5. 5.
   免疫荧光：检测Ki67、细胞角蛋白13（CK13）和P2Y₁₄的表达。
6. 6.
   细胞活力与集落形成实验：使用CCK-8法测定细胞活力，通过集落形成实验评估增殖能力。
7. 7.
   乳酸脱氢酶（LDH）测定：检测细胞膜完整性。
8. 8.
   类器官活力测定：使用类器官活力测定试剂检测药物孵育后的类器官活力。

研究结果

PPTN在体外抑制HeLa细胞、SiHa细胞和宫颈癌类器官的增殖

P2Y₁₄受体在宫颈癌组织、HeLa和SiHa细胞以及宫颈癌类器官中均有明确表达。CCK-8细胞增殖实验显示，PPTN在所有检测时间点均对HeLa和SiHa细胞的生长产生抑制作用。在HeLa细胞中，6小时、12小时和24小时的IC₅₀值分别为22.72 μM、14.66 μM和6.869 μM；在SiHa细胞中分别为20.71 μM、19.71 μM和10.66 μM。研究选取24小时1/2 IC₅₀值作为干预浓度，HeLa和SiHa细胞实际使用的PPTN浓度分别为3 μM和5 μM。集落形成实验证实PPTN显著损害了HeLa和SiHa细胞的集落形成能力。用PPTN处理宫颈癌类器官72小时后，类器官出现明显凋亡，类器官活力测定确认PPTN极大地抑制了类器官生长，其IC₅₀值为34.88 μM。后续类器官实验使用17 μM PPTN。LDH释放实验表明，PPTN破坏了HeLa细胞、SiHa细胞和宫颈癌类器官的膜完整性，其中HeLa和SiHa细胞的最大细胞毒效应出现在处理后6小时。免疫荧光染色结果显示，PPTN处理降低了Ki67的荧光强度，而CK13表达未见明显变化，表明PPTN对宫颈癌类器官的分化未产生影响。

PPTN激活HeLa细胞、SiHa细胞和宫颈癌类器官中的cAMP/PKA/CREB信号通路

由于P2Y₁₄R的激活偶联Gi蛋白并抑制AC通路，导致细胞内cAMP水平降低，研究检测了PPTN处理后HeLa细胞、SiHa细胞和宫颈癌类器官中的细胞内cAMP水平以及PKA和CREB的磷酸化情况。结果发现，PPTN在细胞和类器官模型中均显著增加了细胞内cAMP浓度。与此一致，与对照组相比，PPTN处理后两种细胞系和类器官中PKA和CREB的磷酸化水平均显著上调。

讨论与结论

在嘌呤能受体中，P2Y₁₄R主要在炎症性疾病中被研究。先前的一项研究表明，在溃疡性结肠炎中，P2Y₁₄R通过PKA/CREB/RIPK1信号轴保护肠上皮细胞免于坏死性凋亡。然而，P2Y₁₄R在宫颈癌中的作用仍知之甚少。cAMP在癌细胞中的作用复杂且依赖于环境。在本研究中，P2Y₁₄R拮抗剂PPTN处理增加了细胞内cAMP水平，同时增强了PKA和CREB的磷酸化。抑制P2Y₁₄R导致cAMP/PKA/CREB轴激活，这可能将CREB的转录程序导向生长抑制性靶基因。本研究采用了宫颈癌类器官模型进行体外实验，与传统二维单层细胞培养相比，类器官能更好地保留原发肿瘤的异质性、细胞结构和生物学特征。PPTN显著降低了Ki67荧光强度而未显著改变CK13表达，表明PPTN主要降低了宫颈癌类器官的增殖活性，而未对CK13相关的鳞状分化表型产生可检测的变化。本研究存在若干局限性：仅使用PPTN进行药理干预抑制P2Y₁₄R活性，需要遗传学验证来确认P2Y₁₄R的特异性作用；所有抗肿瘤结果均来自体外细胞和类器官模型，需要体内动物实验验证；PPTN仅在微摩尔浓度下有效，限制了其进一步的临床应用。

研究结论：本研究证明，P2Y₁₄R拮抗剂PPTN抑制HeLa（HPV18⁺）和SiHa（HPV16⁺）宫颈癌细胞以及宫颈癌类器官的增殖。PPTN处理升高细胞内cAMP水平，增强PKA和CREB的磷酸化，从而激活cAMP/PKA/CREB信号轴。这些发现表明，P2Y₁₄R参与了PPTN在两种不同HPV基因型的宫颈癌细胞和宫颈癌类器官中的抗肿瘤效应。