《Drug Delivery and Translational Research》：In vitro, ex vivo and in vivo evaluation of polyelectrolyte nanogels for mucosal vaccines
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鼻内给药作为一种有效的黏膜给药途径，因其适用于无创疫苗递送且能够同时诱导全身性和黏膜免疫应答而受到研究。蛋白质跨越上皮屏障的递送是诱导免疫应答的关键环节。在此框架下，纳米凝胶（nanogels, nGEL）被合理设计用于将递送的抗原呈递给免疫系统，促进其靶向特
鼻内给药作为一种有效的黏膜给药途径，因其适用于无创疫苗递送且能够同时诱导全身性和黏膜免疫应答而受到研究。蛋白质跨越上皮屏障的递送是诱导免疫应答的关键环节。在此框架下，纳米凝胶（nanogels, nGEL）被合理设计用于将递送的抗原呈递给免疫系统，促进其靶向特定免疫细胞群体。研究人员通过聚电解质复合作用制备了基于葡聚糖硫酸酯（dextran sulfate, DS）和ε-聚-L-赖氨酸（?-poly-L-lysine, ?PL）的鼻用纳米凝胶。为释放黏膜疫苗接种的潜力，研究人员评估了纳米凝胶增强抗原穿越黏液屏障递送及促进免疫激活的能力。以荧光素标记的卵清蛋白（fluorescein-labelled ovalbumin）作为模型抗原，研究人员探究了纳米凝胶如何调控抗原转运、细胞摄取和呈递。结果表明，纳米凝胶兼具良好的理化性质与黏液黏附行为，能够与黏液层发生有效相互作用。这一特性转化为在小鼠骨髓来源树突状细胞（Bone Marrow-derived-Dendritic Cells, BMDCs）中增强的摄取和受控的胞内转运，最终促进有效的抗原交叉呈递。重要的是，体内鼻内给药显示，与游离抗原相比，纳米凝胶在气道黏膜内实现了延长的抗原滞留，表明局部抗原可持续存在。此外，在人单核细胞衍生巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MDMs）中的研究提供了纳米凝胶在人相关系统中炎症反应和胞内命运的初步信息。综上所述，这些发现有助于纳米凝胶平台的初步临床前表征，但仍需进一步研究以确定其免疫原性和疫苗效力。
聚电解质纳米凝胶黏膜疫苗递送系统的体外、离体及体内评价——论文解读
传染病依然是全球公共卫生的重大威胁，疫苗接种被公认为预防传染病最有效的手段。尽管疫苗研发取得了巨大进展，许多重大疾病仍缺乏有效疫苗，新发传染病也不断挑战现有防疫体系。当前的研发趋势是鉴定保护性抗原并设计肽基疫苗，以优化抗原呈递、诱导广谱保护性免疫应答并提供更优的免疫原性/风险比。然而，抗原本身往往免疫原性较弱，需要新型佐剂或递送系统来增强免疫应答。蛋白质跨越上皮屏障的递送是诱导免疫应答的关键。在此背景下，聚电解质纳米凝胶（nGEL）——由亲水性聚离子聚合物构成的溶胀网络——作为有前景的递送系统，可通过合理设计将抗原递送至特定免疫细胞群体。纳米凝胶的材料化学组成、尺寸、形状、表面电荷和疏水性/亲水性等固有属性均可影响所诱导的免疫应答类型。与纳米凝胶自身属性同等重要的是给药途径，它显著影响递送系统激发抗原特异性免疫应答的能力。鼻黏膜给药因能同时诱导全身性和黏膜免疫应答而备受关注，且无创、便捷，可实现免针免疫并利于大规模免疫接种。黏膜疫苗可在病原体入侵部位同时激发全身和局部免疫应答，尤其可诱导分泌型IgA，在病原体穿越上皮屏障前予以中和，并促进呼吸道组织驻留记忆B细胞和T细胞的生成，从而在再次接触病原时快速应答。基于此，研究人员前期采用实验设计（DoE）方法，以ε-聚-L-赖氨酸（?PL）和葡聚糖硫酸酯（DS）为原料，制备了包载卵清蛋白（OVA）的聚电解质纳米凝胶用于鼻疫苗抗原递送。该绿色制备方法所得纳米凝胶粒径约150 nm，多分散指数（PDI）约0.2，zeta电位（ZP）约+40 mV，4°C下可保持理化性质稳定达6个月，且在多种细胞中显示出良好安全性，抗原包封效率达95%。然而，该平台在黏膜抗原递送中的适用性仍需深入探究。为此，本研究将异硫氰酸荧光素标记的卵清蛋白（OVA-FITC）包载入纳米凝胶，旨在体外考察纳米凝胶在小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）中的摄取动力学和胞内转运以促进抗原呈递，并在体内追踪其在鼻黏膜的分布与滞留行为。
研究人员首先对包载OVA-FITC的纳米凝胶进行了理化表征，包括平均粒径（Z-Ave）、PDI和ZP测定，并通过体外实验评估其黏液黏附行为及强度，以验证黏附介导的黏液穿透能力。通过共聚焦显微镜在BMDCs中研究摄取动力学和胞内转运，利用OVA257?264特异性T细胞杂交瘤（B3Z细胞）评估抗原交叉呈递效率。随后，通过鼻内滴注给予小鼠OVA-FITC_nGEL，比较其与游离抗原在气道黏膜的滞留时间。最后，在人单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs）中评估纳米凝胶的体外激活效应及其后续吞噬行为，以初步评价其在人细胞模型中的生物相容性。样本来源方面，人外周血单核细胞（PBMC）分离自健康供者的白细胞-血小板浓缩物（buffy coat）；BMDCs衍生自C57BL/6小鼠（雌性，8周龄，购自Charles River，意大利）；体内成像实验使用C57BL/6雄性小鼠（8周龄，购自巴基斯坦国立卫生研究院）。
**OVA-FITC_nGEL的理化特性。** 通过聚电解质复合作用，DS带负电的硫酸基团与?PL带正电的ε-氨基发生静电结合，自发组装形成纳米凝胶。在pH约5的条件下，OVA-FITC的净电荷接近中性，从而避免与?PL发生竞争性静电相互作用，使蛋白主要通过物理截留及残余静电和非共价作用被包封于纳米凝胶网络内。所得制剂均一性良好（PDI<0.3），Z-Ave为204.1±0.5 nm，略高于空白纳米凝胶（155.2±2.9 nm），归因于荧光分子的引入。BCA法测得OVA-FITC包封效率为81.65%±0.20。蛋白加载后ZP从+45.10±2.30 mV降至+31.9±0.9 mV，但仍高于+30 mV，表明颗粒间存在足够的静电排斥以防止聚集。纳米级的粒径有利于与鼻黏膜及抗原呈递细胞相互作用，高正表面电荷不仅赋予胶体稳定性，还可能增强与带负电黏膜环境的静电相互作用，延长给药部位滞留时间，这些特性对黏膜疫苗递送尤为重要。
**nGEL-黏蛋白相互作用及复合物稳定性评估。** 鼻药物递送的主要障碍是快速黏膜纤毛清除，常规制剂在鼻内的清除半衰期仅约15分钟。鼻黏液富含高度糖基化的黏蛋白，其末端唾液酸和硫酸基团赋予糖蛋白负电荷。黏膜黏附可延长制剂在鼻腔的滞留时间，增强与吸收性黏膜表面的接触。研究人员采用三种互补方法评估纳米凝胶的黏附性：nGEL-黏蛋白相互作用研究、浊度分析和结合效率评价。结果表明，纳米凝胶与黏蛋白孵育后粒径显著增加且ZP发生变化，PDI在各时间点均≤0.3，证实形成了更致密、有序、均一的纳米复合结构而非无规聚集体。浊度测定排除了纳米凝胶自身浊度的贡献，吸光度增加主要归因于nGEL-黏蛋白相互作用。在37°C孵育1 h后，黏蛋白结合效率（BE%）达67.6%±0.4%，24 h后仍稳定在55.2%±1.1%，证实纳米凝胶与黏蛋白之间具有强且稳定的相互作用，支持其给药后有效作用于鼻黏膜的能力。
**抗原加工与呈递。** 为测量纳米凝胶是否改善抗原呈递细胞对抗原的摄取及将抗原递送至MHC-I交叉呈递通路的能力，研究人员将BMDCs与游离OVA-FITC、OVA-FITC_nGEL或空白nGEL共孵育，再与OVA特异性B3Z T细胞杂交瘤共培养。B3Z细胞识别由BMDCs加工并呈递于MHC-I H2Kb分子上的OVA257?264（SIINFEKL）肽段后，IL-2启动子元件被转录激活，产生IL-2，其水平与OVA摄取加工相关。结果显示，包载于纳米凝胶中的OVA-FITC被BMDCs摄取加工后，其OVA257?264肽段的呈递程度显著高于游离蛋白。共聚焦显微镜显示，OVA-FITC_nGEL在30分钟时即被高效内化，6小时后摄取效率仍高于游离OVA-FITC。胞内命运方面，OVA-FITC_nGEL与早期内体标记物EEA1、自噬体标记物LC3及内质网（ER）标记物Calnexin存在部分共定位，而未见溶酶体标记物LAMP-1共定位；游离OVA-FITC则主要与EEA1和LAMP-1部分共定位。这表明游离蛋白被内化后主要走向溶酶体降解途径，而纳米凝胶携带的抗原被招募至早期内体和吞噬体，随后转运至内质网，通过MHC-I通路实现交叉呈递，有效避免了溶酶体降解。
**人类固有免疫细胞炎症反应评估。** 为探究纳米凝胶触发炎症免疫应答的能力，研究人员以不同浓度（0.2–5 μg/mL）的空白及OVA-FITC_nGEL刺激人单核细胞和MDMs 24小时，检测促炎细胞因子TNF-α、IL-6和抗炎细胞因子IL-10。结果显示，空白纳米凝胶在两种细胞中均未显著影响TNF-α和IL-6的产生，与强效固有免疫激活剂LPS形成鲜明对比；IL-10的产生也未受明显影响。OVA-FITC_nGEL处理结果类似，仅在最高浓度（5 μg/mL）下单核细胞中细胞因子产生呈不显著的增加趋势。这表明纳米凝胶本身即使在较高浓度下也不能诱导炎症应答，提示其具备良好的安全性特征。这种低促炎特性对黏膜疫苗应用可能是有利的，因为它允许在维持疫苗安全性的同时实现抗原摄取和呈递。
**人巨噬细胞对纳米疫苗的内化。** 巨噬细胞对纳米疫苗的内化是建立免疫的关键步骤。研究人员在MDMs中进行了吞噬分析，通过共聚焦显微镜定性检测。结果显示，MDMs表现出明显的绿色荧光信号，证明纳米凝胶增强OVA抗原摄取的能力显著优于游离OVA-FITC。多个时间点的观察表明，OVA-FITC_nGEL在细胞质内的大型结构中积累并持续存在至少6小时，且不与早期内体标记物EEA1或溶酶体标记物LAMP-1共定位。这种非典型胞内分布表明纳米凝胶在巨噬细胞中通过非经典途径内化，不同于经典内吞途径，也不同于树突状细胞中观察到的转运模式，反映了巨噬细胞中细胞类型特异性的纳米颗粒摄取机制。
**经鼻黏膜给药的纳米疫苗体内与离体追踪评价。** 研究人员通过活体荧光光学成像评估游离OVA-FITC与OVA-FITC_nGEL经鼻内给药后6小时内的命运。结果显示，两种制剂的荧光信号均持续至6小时。给药1小时后，OVA-FITC_nGEL的荧光强度（461.28±58.30 a.u.）显著高于游离OVA-FITC（280.82±36.47 a.u.，p<0.05）；2小时后仍保持显著差异（399.24±35.44 a.u. vs 215.73±36.43 a.u.，p<0.01）。PBS和空白纳米凝胶对照组无信号。值得注意的是，纳米包封避免了抗原向喉部流失，增强了其在鼻腔的定位。腹侧位成像未显示信号，排除抗原积聚于脑组织的风险。离体鼻黏膜荧光分析结果与活体一致：OVA-FITC_nGEL处理的组织在1小时（884.18±33.22 a.u. vs 416.29±29.47 a.u.，p<0.001）和2小时（519.16±28.90 a.u. vs 207.83±30.21 a.u.，p<0.001）的荧光信号均显著高于游离抗原组。纳米凝胶软且可变形的特性使其能够穿透黏液屏障，高含水量和生物相容性减少刺激，支持所包封抗原的持续释放。黏膜黏附特性延长了制剂在给药部位的滞留时间，避免了蛋白在其他组织或器官中的损失。
总结讨论：本研究证实了由DS和?PL组成的聚电解质纳米凝胶作为鼻内疫苗接种载体的潜力。纳米凝胶具备良好的理化性质、高抗原截留效率以及与黏蛋白的相互作用能力。体外研究确认了其被树突状细胞高效摄取、保护抗原免于溶酶体降解以及向交叉呈递相关细胞区室转运的能力。重要的是，即使在高浓度下，该制剂在人单核细胞和巨噬细胞中也不诱导显著炎症应答，提示有前景的安全性特征。但值得注意的是，缺乏细胞因子产生也可能表明免疫刺激活性有限，并且该离体巨噬细胞检测本身不足以评估疫苗制剂的整体免疫原性潜力。体内和离体研究进一步证实纳米凝胶可改善抗原在鼻腔内的定位和持久性，且无蛋白损失或向其他组织的积累。研究结论：本研究证明了基于DS和?PL的聚电解质nGEL作为鼻内疫苗接种载体的潜力。nGEL表现出良好的理化性质、高抗原截留效率以及与黏蛋白的相互作用。体外研究证实其能被树突状细胞有效摄取，保护抗原免于溶酶体降解，并引导抗原向参与交叉呈递的胞内区室转运。该制剂在人单核细胞和巨噬细胞中即使在高浓度下也不诱导显著的炎症应答，提示其具有良好的安全性。然而，细胞因子产生的缺失也可能反映免疫刺激活性有限；该离体巨噬细胞检测本身不能用于评估疫苗制剂的整体免疫原性。体内和离体研究显示，nGEL提高了抗原在鼻腔内的定位和持久性，且无蛋白损失或向其他组织的积累。综上所述，nGEL代表了一种有前景且安全的黏膜疫苗递送平台，研究结果提供了初步概念验证，整合了动物模型的临床前证据与人类相关系统中的初步探索性观察。人源数据尚属初步，需要在得出转化相关性结论前进一步验证，但已为制剂的整体临床前表征作出了贡献，并支持进一步的深入研究。
