《Analyst》：Micro and nanoscale probes for spatiotemporal cell analysis and manipulationOpen Access
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理解动态细胞过程需要能够在保持细胞活力的同时，以高时空精度探测活细胞的技术。常规方法，包括批量组学（bulk omics）、显微注射（microinjection）和电穿孔（electroporation），往往仅能提供静态快照或引起显著的细胞扰动。微纳尺度探
理解动态细胞过程需要能够在保持细胞活力的同时，以高时空精度探测活细胞的技术。常规方法，包括批量组学（bulk omics）、显微注射（microinjection）和电穿孔（electroporation），往往仅能提供静态快照或引起显著的细胞扰动。微纳尺度探针（micro and nanoscale probes）的最新进展正实现前所未有的高精度微创细胞内递送、采样、传感与操控。本综述审视了微纳探针技术的前沿现状，包括流体力学显微镜（FluidFM）、纳米移液管（nanopipettes）、开放空间微流控探针（open-space microfluidic probes）以及纳米针阵列（nanoneedle arrays）。研究人员讨论了这些互补平台如何实现生物分子的受控递送、纵向分子采样、细胞内电生理记录、电化学传感，以及从单细胞到活体组织的时空分辨分析。研究人员特别强调了这些技术通过促进对同一细胞的重复探测、定量分子递送以及具有亚细胞分辨率的多模态测量，从而克服破坏性终点分析局限性的能力。最后，研究人员讨论了剩余的工程挑战，包括提高通量、整合互补传感模态，以及将这些有前景的技术推进为用于培养细胞和组织实验室研究的稳健平台。
1. 引言
生物过程如发育、免疫、细胞分化和疾病进展，通过跨越空间和时间的连续相互作用展开，然而当前技术大多提供静态快照，掩盖了这些动态机制。新兴方法使科学家能够以单分子精度获取、采样和扰动细胞内环境，同时保持细胞活力。常规的货物导入方法，如电穿孔和显微注射，常受限于低摄取效率和显著的细胞扰动。纳米探针可用于在特定时间点将多种货物（包括纳米颗粒、染料、RNA、DNA和蛋白质）引入细胞核或细胞质，并研究递送货物的细胞效应。此外，活细胞可随时间重复采样，提供感兴趣基因型的动态视图而非单一时间点的静态快照。该领域的进展也推动了用于下游分析的样本制备方案的改进，生物技术公司已开始商业化与亚单细胞量RNA兼容的扩增试剂盒，以生成高质量RNA-seq数据集。纳米技术方法正与结构生物学技术（如冷冻电子显微镜（cryo-EM））和先进质谱技术相结合。本综述使用“微纳尺度探针”这一术语涵盖各种在活细胞上建立局部物理或化学界面的技术，包括纳米移液管、纳米针、FluidFM悬臂和开放空间微流控探针。尽管这些平台在几何结构和操作原理上差异显著，但它们共享共同目标：实现微创的细胞过程时空访问。
2. 流体力学显微镜
2.1 通过FluidFM进行细胞内递送
流体力学显微镜（FluidFM）是原子力显微镜（AFM）的改进形式，2009年Meister等人首次描述了将微流体通道整合到悬臂式AFM尖端中的FluidFM。通过施加压力，货物可从AFM尖端喷出，递送量可通过施加压力的持续时间和大小来控制。FluidFM探针可通过自动力反馈精确定位于培养细胞上方，精确控制施加于细胞的力，允许以亚细胞分辨率进行注射，实现受控的细胞质或细胞核注射。FluidFM探针可制造为多种尖端几何形状和孔径，以适应特定应用和货物尺寸。FluidFM已用于向HeLa细胞注射mRNA、质粒和小型细胞外囊泡（sEVs），注射后的sEVs可逃避溶酶体降解并在细胞间转移。此外，FluidFM已用于向中国仓鼠卵巢（CHO）细胞核递送CRISPR组分以生成单和多基因敲除单克隆细胞系，将生成单克隆CHO细胞系的时间从行业标准的超过10周缩短至2–3周。近期一项令人兴奋的应用是通过将完整细菌直接注射到哺乳动物和真菌细胞的细胞质中，研究内共生和宿主–病原体细胞相互作用。2026年，Zare-Eelanjegh等人使用FluidFM探针通过压痕或穿刺HeLa细胞表面施加机械刺激，同时注射肌动蛋白聚合抑制剂，并与荧光寿命成像显微镜（FLIM）整合，实现细胞内张力动力学的实时高分辨率映射。
2.2 Live-seq
Chen等人于2022年建立了Live-seq，这是一种基于FluidFM的开创性技术，允许在特定时间点从活细胞进行压力驱动的RNA提取，并随时间对单个细胞进行重复RNA采样。作为概念验证，作者通过连续分析单个巨噬细胞在脂多糖（LPS）刺激前后的转录组，以及脂肪基质细胞在分化前后的转录组，绘制了细胞轨迹。这项工作建立在2016年Guillaume-Gentil等人的开创性论文基础上，该论文展示了FluidFM进行单细胞活检的潜力，可从活细胞活检0.1–3.2 pL体积，随后进行分子和结构分析。近期FluidFM的一个创造性应用涉及线粒体“移植”的发展，实现了以亚细胞精度从活细胞提取、注射和移植细胞器。
3. 基于纳米移液管的方法
3.1 单细胞纳米注射
一种替代AFM的受控细胞操控方法依赖于扫描离子电导显微镜（SICM），该技术使用纳米移液管进行溶液中的非接触表面形貌映射，并已用于电压驱动的单细胞注射。纳米移液管可轻松从石英毛细管制造为尖端带有纳米孔的针状探针。施加电位差诱导离子电流，该电流随纳米移液管尖端与表面的接近而变化，实现自动定位。纳米移液管还可作为单分子传感器，当单个分子通过尖端纳米孔时引起离子电流的暂时变化，提供关于分子大小、形状、电荷和数量的信息。近期发展将纳米移液管同时作为单分子传感器和纳米注射工具，实现单分子分辨率的细胞内递送，可定量递送荧光探针、纳米颗粒、DNA以及球状和纤维状蛋白质。值得注意的是，纳米移液管传感在细胞内递送过程中的灵敏度和信噪比（SNR）相较于电解质浴有所增强，可能通过大分子拥挤效应实现。单分子纳米注射将实现精确剂量反应研究，但通量较低，约为每小时10个细胞。纳米注射与显微注射相比具有更好的体外细胞活力，使用100 nm纳米移液管24小时后活力为85–92%，而使用500 nm微移液管为36–42%。
3.2 纳米电穿孔
2025年，Marcuccio等人开发了一种基于SICM的替代纳米电穿孔方法，通过单管和双管纳米移液管施加电压脉冲实现局部电穿孔。作者证明施加的电压脉冲数量与递送货物dextran-FITC后的细胞荧光强度线性相关。此外，该方法能够将带电和中性生物分子受控递送到亚细胞区室，这与依赖纳米移液管穿透细胞膜且货物分子需带电的纳米注射形成对比。替代的细胞纳米电穿孔方法包括纳米喷泉探针电穿孔系统（NFP-E），这是一种自动化电穿孔系统，最近已用于CRISPR/Cas9基因编辑，与微约束阵列结合用于培养单个细胞，可向难转染细胞递送质粒、蛋白质和Cas9-核糖核蛋白复合物。
3.3 使用纳米移液管进行单细胞纳米活检
Marcuccio等人开发了一种纳米活检平台技术，通过双管纳米移液管实现飞升级细胞质体积的提取和外来分子的同时注射。该纳米活检方法依赖电润湿而非压力驱动细胞内容物提取。作者使用双管纳米移液管，一个管顺序提取细胞质内容物，另一个管纳米注射荧光标签用于纵向追踪。作者展示了同一细胞及其后代的跨代纵向纳米活检，在72小时内分析基因表达变化，并研究了胶质母细胞瘤细胞模型在化疗和放疗暴露过程中的基因表达变化。纳米活检还可用于直接提取和评估腔内囊泡（ILVs），Ida等人展示了从HEK293细胞直接收集CD63(+)多囊体中的ILVs，并证明其RNA表达谱与细胞质和超速离心分离的细胞外囊泡不同。纳米活检方法还可用于从组织采样RNA，Stanley等人使用机器人纳米移液管平台从乳腺癌组织切片中提取了22个单细胞的RNA。纳米活检方法的改进还用于人类组织线粒体的亚细胞采样，空间分辨率优于激光捕获显微切割。Slotos等人使用机器人纳米移液管采样方法研究了Aβ斑块样沉积物对小鼠小胶质细胞系线粒体空间特征的影响，揭示氧消耗仅在靠近Aβ沉积物的细胞中减少，并发生距离相关的基因表达模式。
3.4 介电泳纳米镊子
Nadappuram等人开发了微创纳米镊子，可从活细胞以单分子分辨率提取物质。这些纳米镊子基于双管碳纳米移液管，包含两个由10–20 nm间隙隔开的紧密间隔电极。施加AC电压产生电场梯度，允许介电泳捕获生物分子。作者展示了捕获单分子并从活细胞提取核酸用于基因表达分析而不损害细胞活力，还展示了捕获和提取单个线粒体。Sahota等人也使用该技术从活神经元提取单个线粒体，研究了α-突触核蛋白聚集体暴露后线粒体基因MT-ND1和MT-ATP6的下调，并应用纳米镊子绘制海马神经元胞体和树突中RNA区室化图谱，追踪NMDA受体刺激后树突棘区域mRNA的相对丰度。
4. 开放空间微流控
在过去二十年中，开放空间微流控已成为精确、微创活细胞操控的强大策略。最早且最成熟的实施例之一是开放通道，其中细胞被限制在暴露于周围环境的固定几何结构中。Hsu等人首次展示了开放空气“微运河”，实现直接微移液管访问用于膜片钳记录和培养细胞的胞内注射。Murakami等人将确定性单细胞捕获与自动化机器人移液结合，允许单独捕获的细胞被检索并转移到标准孔板。Bansho等人将该方法扩展了两个数量级，通过周期性间隔的旁路通道解决颗粒堵塞问题，展示了超过10,000个陷阱的阵列和约95%效率的Jurkat细胞可重复单细胞捕获。Taylor等人引入流体动力学定义的虚拟通道，可实时重新配置。微流控探针（MFPs）使用流体动力学定义的边界直接在开放水环境中塑造微尺度液体域，无需任何物理通道结构。MFPs可实现试剂在微米精度下的局部递送、限制和移除。Zhang等人使用MFP将短寿命自由基限制在微米级区域，用于亚细胞位点的选择性膜刺激。Song等人应用该技术控制膜损伤和实时修复动力学，并通过局部穿孔递送功能性货物。Gao等人建立了灌注微移液管可空间分辨单细胞水平的氧消耗。Zhou等人将酶促电化学检测整合到抽吸通道中，量化受控葡萄糖灌注下的实时乳酸分泌。Feng等人使用开放MFPs通过局部刺激单个胶质瘤细胞研究细胞间信号传递，展示了通过肿瘤微管的定向钙传递。Proulx等人使用多重开放空间平台表明Notch通路输出由信号占空比而非总剂量控制。Zhang等人使用水性两相系统解耦限制与流体力学，实现亚细胞刺激的更清晰边界。Hu等人通过形成45°探针头解决垂直探针整合与透射光学成像的挑战。Holler等人开发了μKiss方法，使用两个对流微移液管通道将试剂从亚飞升级限制体积直接刷到细胞膜上，实现约1 μm空间精度和35 ms时间分辨率。MFPs已与互补分析和扰动技术整合，Brimmo等人将电透化与流体动力学流限制结合用于活检贴壁细胞，Sofela等人扩展该方法用于靶基因表达分析和液滴区室化。Lovchik等人将MFP限制应用于免疫组织化学，将多步染色方案从数小时缩短至数十分钟。
5. 纳米针阵列
5.1 用于细胞操控的纳米针阵列
纳米针涵盖广泛的垂直纳米结构，包括纳米线、纳米柱、纳米吸管、纳米管和纳米针。它们提供对细胞内空间的直接访问，同时保持细胞活力和功能，支持生物分子递送、细胞内传感和跨细胞群的可扩展并行分析。纳米针非常适合细胞操控，因为细胞倾向于粘附、吞噬并与垂直纳米探针建立紧密界面。它们可组装成大型阵列，实现对数百至数千个细胞的同步分析。细胞–纳米针界面由动态的瞬时直接访问、膜透化和内吞刺激相互作用控制。纳米针通常在初始界面期间实现自发访问，但这种状态是瞬态的，访问窗口通常约为10分钟，可通过光穿孔等专门光学技术或优化探针几何结构延长至80分钟至24小时。纳米冠等专门架构可使膜紧密包裹纳米结构边缘，将细胞内访问窗口延长超过20倍，实现长达1.5小时的稳定细胞内电生理记录。表面功能化可促进膜透化以实现细胞内生物分子交换。细胞–纳米针界面受纳米结构曲率和表面形貌控制，驱动局部细胞活动，包括机械传感和内吞作用。电子显微镜和3D单分子超分辨率定位显微镜直接可视化显示小窝、网格蛋白包被凹坑和膜包裹围绕纳米柱的招募。纳米针还可诱导超越质膜的生物物理刺激，改变肌动蛋白纤维和中间丝的动态和排列，重塑核被膜及其分子组成，诱导核区室的暂时性破坏，形成使核–细胞质分子交换不受控制的开孔，这些暂时性开口由内体分选复合物（ESCRT-III）机制主动修复。纳米结构电极在建立细胞–纳米探针接触后，可在群体规模实现高保真细胞内记录而不损害细胞活力。中空纳米柱或多孔PET模板诱导局部膜包裹以实现高密封电阻，实现媲美膜片钳的长期高保真细胞内记录。纳米线阵列在3D完整脑组织中实现准细胞内记录，展示纳米电极电生理学在体内的可扩展性。纳米针电极还实现细胞内环境的实时多分析物分析，包括代谢通量（如ROS、NADH）和信号分子（如H2O2、多巴胺）的追踪。
5.2 用于单细胞活检的纳米针阵列
纳米针提供对细胞内空间的直接、非破坏性访问，允许从活细胞重复提取而不损害其活力或功能。提取的物质可非特异性地收集用于广泛组学分析，或通过表面功能化探针选择性捕获特定分析物。非特异性批量提取可通过电穿孔实现，驱动多阴离子物质（如RNA）通过纳米探针电泳迁移到收集储液器中，该原理首次使用氧化铝纳米吸管作为进入细胞质的流体导管。靶向分析依赖于将适体或CRISPR-Cas机制等探针共价或非共价偶联到纳米探针表面，允许在生物界面特异性识别预定义分析物。这些基于纳米探针的导管的主要优势是能够进行纵向转录组和蛋白质组追踪，允许在72小时或更长时间内进行重复、非破坏性采样。该策略的另一个应用是急性髓系白血病细胞系中的单细胞microRNA分析，通过离心介导的机械穿透实现细胞内访问。将这些能力扩展到潜在临床应用需要通量和细胞及组织活力的实质性进展，包括能够穿越实体肿瘤特征性的致密细胞外基质、基质刚性和可变免疫细胞浸润。多孔硅纳米针已整合到生物可吸收、柔性弹性体中，创建能够在一个界面内进行核酸递送和提取的平台。该领域正朝着直接从活组织生成非破坏性分子印记的方向发展，印记的质谱分析可解析活体胶质瘤组织的空间和时间脂质组动力学，可能将范式从静态快照转变为活体组织的纵向四维分析。
