基于DESolve增溶与肠溶微囊化的两性霉素B口服递送系统用于囊性纤维化肠道症状治疗

《International Journal of Pharmaceutics》：Microencapsulation of an amphotericin B-solubilising mucolytic deep eutectic solvent for enhanced oral delivery to treat cystic fibrosis

　　

本研究旨在开发一种创新的两性霉素B（AmB）口服制剂，用于治疗囊性纤维化（CF）相关肠道症状，该制剂采用通过滴制/振动技术（prilling/vibration technique）制备的微囊。使用黏液溶解性深共熔溶剂（DESolve）旨在通过降低黏液黏度改善AmB的溶解度及其穿过黏液屏障的扩散。在纯化肠道黏液和黏蛋白中的扩散试验证实其能够穿透CF典型的厚黏液屏障，提高靶部位药物可用性。在Caco-2/HT29 MTX E-12细胞上的体外分布研究表明，与H₂OAmB相比，DESolve显著增加细胞相关AmB量，表明药物与上皮区室结合增加，这可能促进AmB进入细胞膜，在此其可能发挥形成离子通道的活性。为实现口服给药并保护药物免受胃降解，将溶于DESolve的AmB（DESAmB）作为核心通过滴制/振动技术微囊化。选择了一种外聚合物壳，可保护AmB免受胃降解并确保在小肠靶向释放。微囊成功制备，产率高达90.49%，包封效率为96.04%。粒径分析和扫描电子显微镜证实其粒径分布均一、呈球形、表面光滑、无裂纹和孔隙。膨胀研究和模拟胃肠液中的药物释放试验证明该制剂能够在肠道环境释放AmB。这些结果突出该双重策略，即使用黏液溶解性DESolve与肠道靶向释放微囊，作为AmB口服给药的一种创新、稳定且有效的策略的潜力，为CF患者提供更可及的替代方案并改善治疗依从性。

囊性纤维化（CF）是常染色体隐性遗传病，由CFTR基因突变导致CFTR蛋白（一种氯通道）功能受损，影响跨细胞膜水电解质平衡。突变可影响肠道、呼吸上皮、胰腺和生殖系统外分泌腺，产生厚黏稠黏液，阻塞气道和胃肠道（GIT）。虽然肺部表现为主，但肠道紊乱常被忽视。异常盐转运导致肠动力降低、梗阻、十二指肠中和胃酸缓冲能力下降、炎症、体重下降和菌群失调，机会性病原体增殖。CFTR功能障碍导致厚黏稠肠黏液，阻塞胰管，引起外分泌胰腺功能不全、消化酶分泌减少和营养吸收不良；黏液水化改变和肠腔pH促进菌群失调、上皮屏障受损和慢性低度炎症，增加肠道通透性并维持炎症，影响生长、营养状态和生活质量。传统治疗主要管理并发症，不直接针对病因。两性霉素B（AmB，多烯大环内酯类抗真菌药）用于系统性真菌感染和利什曼病，近期作为CF治疗有潜力。其可在上皮细胞顶面形成非选择性离子通道，绕过CFTR缺陷，部分恢复离子和液体转运，独立于特定CFTR突变，可能为通用疗法。但膜相互作用也带来毒性，AmB优先与含麦角甾醇真菌膜作用，但非绝对，可与哺乳动物胆固醇相互作用，改变膜通透性，造成宿主细胞毒性；毒性呈剂量和暴露依赖，肾毒性风险随累积暴露增加。控制AmB暴露部位和程度重要。脂质体AmB（AmBisome?）改变处置，减少游离药物和肾脏暴露，肾毒性较低。AmB市售为胃肠外制剂，需住院和长时间输注。口服开发受限于理化性质：AmB是两性且两亲多烯大环内酯，高分子量，含疏水共轭七烯区和亲水多元醇区，有可电离羧基和氨基；水溶性差，上皮通透性有限，属BCS IV类，口服生物利用度极低；多烯链在酸性胃环境易质子介导降解，导致胃肠道转运中失活。已有纳米颗粒、脂质和自乳化等口服策略，MAT2203脂质纳米晶临床研究有鼓励结果，但无口服AmB上市。深共熔溶剂（DES，由氢键供体和受体形成的低共熔混合物）近年来用于改善难溶药物递送，尤其BCS II和IV类。先前研究开发了含N-乙酰半胱氨酸（NAC）的黏液溶解DESolve，可断裂黏液中糖胺聚糖二硫键，治疗CF厚黏液并增加模型药物扩散。DESolve低毒、可生物降解、制备简单、原料便宜，可改善难溶药物溶解度和生物利用度。本研究评估DESolve作为AmB载体，增加溶解度、改善黏液扩散、增加肠上皮模型细胞相关AmB。但DES存在理化稳定性和胃肠道不受控释放局限。因此结合两种策略：DESolve增强溶解度、黏液穿透和上皮渗透；微囊化保护胃降解并靶向肠道释放，改善口服适用性。

研究人员制备DESolve（NAC与精氨酸1:1 M，加28% w/w水，80 °C 30 min），用DSC、TGA、¹H NMR和Ellman试验表征；用高效液相色谱（HPLC）定量AmB。用旋转管法在猪肠黏蛋白和纯化猪小肠黏液（来自当地屠宰场）中评价扩散；用Caco-2/HT29-MTX-E12（90:10）共培养模型、PrestoBlue细胞活力、转运与细胞摄取、跨上皮电阻（TEER）评价。用滴制/振动技术（B395 Pro Encapsulator）优化S1-S10聚合物进料，以钠藻酸盐和Eudragit? L 30 D-55为壳、DESAmB为核心、CaCl₂凝胶浴、冻干制备微囊。表征产率、包封效率（EE）、药物载量（DL）、尺寸、扫描电子显微镜（SEM）、流动性、膨胀、释放和稳定性。

研究结果：3.1 DESolve制备与AmB溶解度。DESolve按前研究制备，NAC:精氨酸1:1加28%水，室温稳定液体，DSC/TGA/NMR/Ellman确认性质。AmB在DESolve中溶解度2.1±0.29 mg/mL（25 °C），水中2.87 μg/mL，说明DESolve显著改善水溶性。3.2 黏蛋白和黏液扩散评价。旋转管法6 h，五段。黏蛋白中H₂OAmB第一段60%，逐渐下降；NACAmB第一段42%；DESAmB第一段24.59%，后续递增至第五段21.64%，显示深穿透。黏液中H₂OAmB第一段84%，第二段停止；NACAmB主要第一/二段；DESAmB第三、四段显著高于NACAmB，可到最后段。结论DESAmB有效穿过厚黏膜层，改善AmB扩散；精氨酸主要参与DESolve分子组织，而非独立直接黏液溶解。3.3 细胞活力筛选与实验条件选择。AmB 10、25 μg/mL不显著影响活力，40 μg/mL降至约86%（p<0.0001）；选择25 μg/mL。DESolve 1、2、3均不影响活力，选择DESolve 2（12.42% v/v，相当于48.71 mg/mL NAC）。DESAmB（25 μg/mL AmB加DESolve 2）不显著降低活力；Triton X-100阳性对照降至约5%。3.4 AmB分布研究。Caco-2/HT29-MTX E12共培养2 h。H₂OAmB 88.55%留在apical，basolateral 4.20%，细胞裂解物2.21%；DESAmB apical 15.98±3.63%，basolateral 8.81%，细胞裂解物66.01%。结论DESolve降低黏液屏障，促进药物与上皮直接接触，增加细胞相关AmB。体外结果不能结论全身吸收。3.4.1 TEER。对照稳定；DESolve 1 h降至153.0±10.4 Ω·cm²，2 h 126.0±7.8；DESAmB 1 h 126.0±5.7，2 h 108.0±4.2；H₂OAmB仅2 h显著下降至387.9±2.3。归一化后DESolve和DESAmB降至约32.0/26.4%和25.4/21.8%，H₂OAmB 94.9/86.2%。细胞活力未显著下降，说明TEER降低是DESolve依赖的黏液相关上皮屏障调节，而非细胞毒性；DESolve是主要贡献者。3.5 微囊生产。选择Eudragit? L 30 D-55和钠藻酸盐为壳。S1-S3因2%藻酸盐黏度高、难加工、不规则；1%藻酸盐改善S4-S10。S4-S5冻干后易碎；S6-S7机械变形；S8-S10可加工、球形、好处理。优化后S8外喷嘴600 μm产率46.97%，凝胶浴乳光因DESolve损失；S9外喷嘴700 μm产率72%，尺寸均一，不黏不塌，被选中。S10加3% w/v甘露醇，同S9比和条件，用于比较F与FM。3.6 产率、EE和DL。F产率71.55%，EE 68.18%，DL 792.17±26.03 μg AmB/g；因孔和不规则表面，F未进一步。FM产率90.49%，EE 96.49%，DL 877.84±37.82 μg/g。结论甘露醇作为填充剂增加固体含量，形成更致密均匀壳，减少冻干裂纹，提高产率和EE。尚无法确定临床所需FM量，因CF治疗有效口服剂量未建立。3.7 尺寸、形态和流动性质。SEM显示F和FM较球形，F有裂纹，截面F多孔，FM更紧凑少孔。FM水合平均直径2038 μm，冻干1442 μm，SrF 0.293；d50 1442 μm，d10 1279 μm，d90 1618 μm，Span 0.236。适合儿科（小于1.8 mm上限）。休止角11.29°，Carr指数5.97，Hausner比1.06，流动和压缩性优异。3.8 膨胀研究。pH 1.2时30 min内适度水合，最大Sw 2.5，稳定无侵蚀；Eudragit不溶限制水扩散。pH 5.5急剧膨胀；pH 6.8约3 h达峰值Sw≈4.9；pH 7.5急剧下降，结构去稳定/崩解。结论pH响应性，肿胀控制释放，适合十二指肠和空肠靶向。3.9 释放研究。pH 1.2无AmB释放；pH 5.5 15 min约30.67%；pH 6.8累计79.49%（4.25 h）；pH 7.5 5 h内完全释放。结论胃保护，小肠靶向控制释放。3.10 稳定性研究。游离AmB稳定性有限，2个月25 °C明显下降，40 °C降至22.15%。FM 2个月4 °C几乎不变，25 °C中度下降，40 °C降至25.43%；6个月4 °C EE 74.22%，25 °C 53.33%。无颜色变化或表面劣化。结论FM改善AmB储存保存，尤其冷藏；保护作用归于FM微囊系统整体，而非仅甘露醇，因未纳入F长期稳定性。

总结讨论与结论：本研究使用先前开发并完全表征的DESolve改善AmB在黏液中溶解度和扩散，潜在用于产生厚黏液的CF患者肠道症状。DESolve显示强黏液溶解活性，促进药物扩散并显著增强AmB在肠道的生物利用度；结论原文称在basolateral室未检测到AmB，表明所研究体外条件下无可检测跨上皮通过。这些发现表明AmB与上皮区室结合增加，但不能结论体内全身暴露。基于此，DESAmB成功微囊化于pH敏感聚合物系统（藻酸盐和Eudragit? L 30 D-55），获得可保护胃转运并促进小肠靶向释放的口服制剂。微囊在形态、稳定性和释放方面广泛表征，证明其保护胃环境并确保肠道控制释放。DESolve和微囊化提供互补功能：DESolve增强黏膜穿透，微囊化在模拟胃条件下保持药物完整性。总体，结果为两步药物递送策略提供药学概念验证：AmB先纳入黏液溶解DES改善增溶和与黏液屏障相互作用，再微囊化于胃抵抗聚合物系统实现肠道递送。多颗粒性质可能在剂量灵活性和口服给药便利性方面有优势。该方法代表未来开发针对CF肠道表现的口服治疗策略的有前景药学平台，并为进一步药学和临床前研究提供基础。局限：主要关注体外开发与表征，未直接研究AmB对上皮细胞膜离子转运的药理作用；完整制剂的局部和全身安全性需进一步研究；治疗相关性需在合适体内CF模型确认，同时需研究药代动力学行为和潜在全身暴露。