《Journal of Chromatography A》：A mini SPE purification method for the simultaneous determination of 15 mycotoxins in
Ginkgo biloba leaves and their extracts by UHPLC-MS/MS
编辑推荐：
•开发了一种微型固相萃取柱，其填料量为常规柱的1/4。•采用同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱法（ID-UHPLC-MS/MS）定量测定银杏叶及其提取物中的15种真菌毒素。•该方法具有优异的灵敏度、可接受的回收率和精密度。•实际样品分析结果显示真菌毒素污染水平较低。•银杏叶对
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开发了一种微型固相萃取柱，其填料量为常规柱的1/4。
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采用同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱法（ID-UHPLC-MS/MS）定量测定银杏叶及其提取物中的15种真菌毒素。
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该方法具有优异的灵敏度、可接受的回收率和精密度。
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实际样品分析结果显示真菌毒素污染水平较低。
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银杏叶对三种关键产毒真菌表现出明显的抑制作用。
引言
真菌毒素是真菌的次级代谢产物，可能在作物生产的多个阶段产生，包括生长、收获、储存和加工过程。目前已鉴定出400多种真菌毒素，其中多种具有重要的毒理学关注价值，因其具有致癌、肝毒性 [1,2]、肾毒性、免疫毒性和内分泌干扰效应 [[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]]。根据国际癌症研究机构（IARC）的分类，黄曲霉毒素B?（AFB?）被列为1类致癌物；赭曲霉毒素A（OTA）、伏马菌素B?（FB?）、伏马菌素B2（FB?）和刺头曲毒素（ST）被归类为2B类致癌物；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和尼泊毒素（NIV）被列为3类致癌物 [10]。除上述公认的危害外，隐蔽型真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（DON-3G）也值得特别关注，因为它能逃避常规检测，同时在人体内仍有被水解还原为其有毒苷元（DON）的潜力，构成一种不应在草药安全性评价中忽视的潜在健康风险。真菌毒素污染不仅广泛存在于谷物和饲料中，还被报道存在于草药和药食两用植物材料中。包括黄曲霉毒素、ZEN、OTA、伏马菌素和DON [11,12] 在内的多种真菌毒素已在柏子仁、土鳖虫 [13]、薏苡仁 [14]、生姜和人参 [[15], [16], [17]] 等中药材中被检测到。此外，2025年版《中国药典》[18] 进一步修订了特定药材中关键真菌毒素的限量标准，反映出对此类污染问题的监管关注日益升级。综合而言，真菌毒素的高毒理学危害、在药用植物基质中已有文献报道的污染普遍性，以及官方监管要求，都凸显了对这些高风险真菌毒素进行同步筛查的紧迫性，以确保草药产品的安全性。
银杏叶已被正式收录于《中国药典》，广泛应用于草药和健康相关产品 [[19], [20], [21], [22]]。银杏叶提取物富含药理学活性成分，如黄酮类和萜类内酯，是多种剂型（如片剂、胶囊、注射剂）的重要原料成分，在心脑血管疾病和神经系统疾病的治疗管理中具有广阔的应用前景 [[23], [24], [25]]。随着银杏来源产品消费量的不断扩大，其安全性评价变得越来越重要。然而，关于银杏叶尤其是其提取物中真菌毒素污染的系统分析数据仍然非常有限。因此，建立适用于这些基质中多真菌毒素测定的可靠分析方法，不仅对产品安全性评估具有重要意义，也对银杏产业链中的过程控制至关重要。
近年来，超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）已成为食品、植物及其他复杂植物来源基质中多真菌毒素分析的常用方法。该方法可在单次运行中同时分析多种真菌毒素，对污染物具有高的灵敏度和定量准确性 [26,27]。为进一步提高分析准确性，同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱法（ID-UHPLC-MS/MS）采用稳定同位素标记的内标有效校正了基质效应 [28]。对于银杏叶及其提取物等高度复杂的植物样品，有效的样品净化仍然必不可少。尽管ISO 23719 [29] 规定的直接萃取稀释法操作简单，但其净化能力有限。固相萃取（SPE）能更高效地去除共萃取杂质 [30]。然而，其常规应用往往伴随着相对于最终实际制备用于UHPLC-MS/MS分析的样品体积而言过量的净化过程。如表S1所示，在几种基于杂质保留、分析物通过的SPE净化方法中，净化过程中通过柱体的处理体积远大于最终转移至进样瓶的溶液体积，表明溶剂用量和吸附剂容量可能超出了仪器分析的实际需求。这一差异表明，部分净化体积、溶剂消耗和吸附剂用量超出了最终仪器样品制备的实际需求。在常规分析中，这种冗余可能导致溶剂和填料材料的非必要浪费，并增加分析成本。因此，在保持相同净化原理的前提下缩小SPE规模，是提高资源利用效率并更好地适应UHPLC-MS/MS分析实际所需体积的实用策略。基于这一考虑，本研究采用了一种填料量为标准商用SPE柱四分之一的微型SPE柱。该设计将净化所需的溶剂体积从2 mL（标准商用SPE柱用量）减少至1 mL，同时保持有效的净化效果并减少吸附剂消耗。
基于上述原理，本研究开发了一种微型固相萃取净化策略，并将其与同位素稀释UHPLC-MS/MS联用，用于同时测定银杏叶及其提取物中的15种真菌毒素，包括AFB?、AFB?、AFG?、AFG?、OTA、ZEN、DON、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-AcDON）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-AcDON）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（DON-3G）、NIV、FB?、FB?、FB?和ST。该策略并未引入新的吸附剂化学，而是在减少吸附剂用量和溶剂消耗的同时保留了传统SPE小柱原有的净化机制。通过这种方式，所提出的方法在不牺牲复杂植物基质有效净化实际需求的条件下提高了资源利用效率。此外，本研究还评估了银杏叶乙醇提取物对三种代表性产毒真菌——尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌和黄曲霉的抑制作用，以初步了解该植物基质的潜在抗真菌特性。
章节摘要
仪器与材料
本研究使用以下仪器：密理博超纯水系统（Millipore，美国马萨诸塞州波士顿），超声波清洗器（杰拓尔，中国深圳），多管涡旋混合器（VX-IV，SCDEALL，中国北京），5424R和5430R高速冷冻离心机（Eppendorf，德国汉堡），旋转蒸发仪（BUCHI Labortechnik，瑞士弗劳伊尔），以及QTRAP? 6500+ LC-MS/MS系统（SCIEX，美国马萨诸塞州弗里汉）。HPLC级甲醇、乙腈（ACN）、甲酸（FA）、乙酸（AA）及
水相流动相的优化
调节流动相组成可以提高目标真菌毒素的分离效率和灵敏度 [33]。本研究以甲醇作为有机相，水相由0.1%（v/v）FA和三种浓度的NH?OAc（1、5和10 mmol/L）组成。采用相同的梯度洗脱程序，分别在不同的流动相组成下评估了15种真菌毒素的响应强度（混合标准溶液的浓度为
结论
本研究建立了一种基于微型固相萃取的同位素稀释UHPLC-MS/MS方法，用于同时测定银杏叶及其提取物中的15种真菌毒素。该方法采用仅含常规量四分之一吸附剂的微型SPE柱，成功减少了吸附剂和溶剂的消耗。系统优化和验证确认了该方法具有优异的灵敏度和可接受的回收率（73.67%-129.05%）。对52个商业样品的应用分析显示，DON及其
CRediT作者贡献声明
刘聪敏：数据整理、正式分析、写作-审阅与编辑。童新佳：概念设计、数据整理、正式分析、调查研究、方法论、写作-原稿撰写。苗青：项目管理、数据整理、验证。李丽：数据整理、正式分析、指导监督、验证、项目管理。叶金：方法论、正式分析、项目管理、资源提供。宣志红：数据整理、调查研究、验证。倪宝霞：指导监督，
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刘聪敏：写作-审阅与编辑、正式分析、数据整理。童新佳：写作-原稿撰写、方法论、调查研究、正式分析、数据整理、概念设计。苗青：验证、项目管理、数据整理。李丽：验证、指导监督、项目管理、正式分析、数据整理。叶金：项目管理、方法论、正式分析。宣志红：验证、调查研究、数据整理。倪宝霞：验证、指导监督，
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文所报道工作的已知竞争性经济利益关系或个人关系。
致谢
作者衷心感谢以下资金支持：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（ZYJGKX202417）；广西关键研发计划（AB24010013）；国家粮食和物资储备局科学研究院基本科研业务费专项资金（ZX2432）。
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