基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的高灵敏度、抗基质干扰方法用于真菌微塑料降解体系中己二酸的准确定量分析

《Journal of Chromatography Open》：A high-sensitivity and matrix-resistant liquid chromatography - high resolution mass spectrometry (LC–HRMS) method for accurate quantification of adipic acid in fungal microplastic degradation systems

　　

摘要专业翻译 微塑料污染已成为一个普遍存在的环境问题，推动微生物降解作为可持续缓解策略的研究日益受到关注。在各类微生物降解菌中，真菌在分解可生物降解聚合物（如聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT））方面展现出相当大的潜力。准确定量己二酸（AA）——PBAT解聚过程中释放的关键脂肪族单体——对于阐明降解途径至关重要。然而，AA在降解早期阶段通常以低浓度存在，且其在真菌培养物中的检测受到菌丝生物量、培养基组分和未知中间体所导致的基质效应阻碍。现有的分析技术，包括高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）、紫外-可见分光光度法（UV-Vis）和气相色谱-质谱联用（GC-MS），不足以满足此目的。相比之下，液相色谱-质谱联用（LC-MS）已越来越多地应用于聚合物降解产物的鉴定和定量。尽管LC-MS已成功定量了环境样品中PA6/PA66酸解聚单体（6-氨基己酸和AA），但其在真菌降解微塑料过程中产生的AA分析中的应用仍未得到探索。本研究通过开发一种全面优化、无需衍生化的LC-HRMS工作流程填补了这一空白，能够在复杂的真菌PBA-PU降解环境中实现AA的精确、可重复定量。该方法表现出优异的线性、准确性和对基质干扰的稳健抗性。快速简化的提取方案可从复杂生物基质中有效回收AA。将该方法应用于真菌降解实际样品，能够灵敏、准确地监测PBA-PU解聚过程中AA的释放，为阐明降解途径提供了有力工具。该方法的检测限（LOD）为5 ng/mL，定量限（LOQ）为15 ng/mL，线性范围为20–3200 ng/mL，基质效应仅为-0.519%，日内精密度（RSD）为3.55%–7.39%，日间精密度（RSD）为7.32%–8.50%，加标回收率为89.32%–104.19%。

论文解读

一、研究背景与意义

微塑料污染已成为全球范围内备受关注的环境问题。塑料制品的广泛使用及其在环境中的持久性累积，对生态系统和人类健康构成了潜在威胁。在此背景下，微生物降解被视为一种具有可持续发展前景的塑料污染治理策略。在众多微生物降解菌中，真菌因其能够分泌多种胞外酶并具有较强的环境适应能力，在分解可生物降解聚合物方面展现出显著潜力。聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）作为一种广泛应用的生物可降解塑料，其降解过程受到研究者的重点关注。同时，具有明确化学组成和结构的固态聚酯-聚氨酯（PBA-PU）材料常被用作研究聚氨酯（PU）降解的模式底物。己二酸（AA）作为PBAT和PBA-PU解聚过程中释放的关键脂肪族单体，其准确定量对于阐明微生物降解途径、评估降解效率具有重要的科学意义。

然而，AA的定量分析面临多重挑战。首先，在降解早期阶段，AA通常以痕量浓度存在，对检测灵敏度提出了较高要求。其次，真菌培养体系中存在的菌丝生物量、培养基组分以及未知的降解中间产物会产生显著的基质效应，严重干扰AA的准确检测。现有的分析技术各有局限：高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）选择性有限，难以将AA与结构相似的内源性化合物有效分离；气相色谱-质谱联用（GC-MS）通常需要对AA进行衍生化处理以增强其挥发性，这一步骤增加了操作的复杂性和结果变异性，且仍无法有效克服基质干扰；热裂解-GC-MS等面向聚合物的先进方法则更适用于聚合物鉴定而非单体定量，缺乏追踪PBAT降解产物所需的分子特异性。尽管液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术已在环境样品中成功定量了PA6/PA66的酸解聚单体，但将其应用于真菌降解微塑料过程中产生的AA分析仍属空白。因此，开发一种高灵敏度、高选择性且具有抗基质干扰能力的LC-MS方法用于痕量AA分析，具有迫切的现实需求。

二、研究内容概述

研究人员针对上述问题，开发并系统验证了一种无需衍生化的液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）方法，专门用于复杂真菌微塑料降解体系中AA的定量分析。研究采用Cladosporium oxysporum SCSIO 81042菌株对PBA-PU塑料粉末进行降解实验，在0、3、5、7、10和12天的时间点采集样本，通过优化的样品前处理流程和LC-HRMS分析，实现了对AA释放浓度的动态监测。该研究填补了LC-MS方法在真菌微塑料降解基质中定量AA的空白，为微塑料生物降解研究提供了可靠的分析平台。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：第一，液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）联用技术，使用Vanquish Flex超高效液相色谱（UHPLC）系统耦联Q Exactive Focus高分辨质谱仪，在负离子电喷雾电离（ESI-）模式下采用平行反应监测（PRM）模式进行数据采集；第二，同位素稀释定量法，以氘代己二酸（AA-d8）作为内标，通过分析物与内标的峰面积比进行定量计算；第三，基质匹配校准曲线法，通过在空白基质中添加已知浓度的AA标准品制备校准曲线，以消除基质效应对定量结果的影响。样品前处理采用简化的两步提取方案：首先通过0.22 μm滤膜过滤去除不溶性杂质，随后采用甲醇进行100倍稀释和蛋白沉淀，利用甲醇对AA的良好溶解性以及对无机盐的不溶性实现目标物的高效提取和干扰物的有效去除。研究样本来源于Cladosporium oxysporum SCSIO 81042菌株在含3%海盐的无机盐培养基（MSM）中对PBA-PU塑料粉末的降解培养体系。

四、研究结果

色谱条件优化结果：研究人员采用单变量逐一优化策略，系统考察了色谱柱类型、流动相组成、流速和柱温对AA保留行为和离子响应的影响。在色谱柱选择方面，比较了三种不同的C18色谱柱，结果显示Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱产生的信号强度最高（1.015×10⁷），比另外两种色谱柱高约10%–26%，且获得了最长的保留时间（3.08 min），有利于将AA与复杂真菌降解基质中的早期洗脱干扰物分离。在流动相选择方面，甲醇作为有机相时AA的色谱响应（1.015×10⁷）比乙腈（5.90×10⁶）显著更高，信号强度提升72%，保留时间更长（3.09 min vs 1.63 min），且方法稳定性更优（RSD=0.49% vs 3.50%）。在流速优化方面，0.15 mL/min时出现严重的峰分裂现象，而0.20 mL/min时获得最大响应（1.85×10⁵）和对称峰形。在柱温优化方面，随着温度从25°C升高至55°C，AA保留时间从3.19 min线性降至2.85 min，信号强度降低约61%；30°C时获得更好的精密度（RSD=1.97%），因此被选为最佳柱温以平衡灵敏度、精密度和方法稳定性。

质谱条件优化结果：AA的前体离子精确m/z为145.04996，在负离子模式下产生两个特征碎片离子：m/z 83.04929（定量离子）和m/z 101.05994（确证离子），质量误差分别为0.95 mDa和0.86 mDa，符合欧盟实施法规（EU）2021/808规定的±5 ppm或±1 mDa的判定标准。碰撞能量优化显示，碎片离子强度在10 eV时达到峰值（1.81×10⁶），随着碰撞能量增加急剧下降，因此选择10 eV作为最佳碰撞能量。喷雾电压从2.5 kV升至3.8 kV时，信号强度从1.08×10⁶增至1.69×10⁶，提升56.5%；3.8 kV时精密度更优（RSD=0.35%），故选择3.8 kV。毛细管温度在280°C时信号强度最高（8.25×10⁵）。鞘气流量在15–50 arb范围内对信号影响较小（最大变化2.9%），30 arb时精密度最佳（RSD=0.43%）。辅助气流量在4 arb时同时获得高响应强度（8.26×10⁵）和优异精密度（RSD=0.61%）。辅助气加热温度在300°C时精密度最佳（RSD=0.45%）。S-lens RF电平在52时信号强度最高（1.38×10⁶）且精密度极佳（RSD=0.0%）。

方法验证结果：方法验证参照欧盟实施法规（EU）2021/808和ICH Q2(R2)指南进行。特异性方面，空白MSM培养基、PBA-PU微塑料和Cladosporium oxysporum SCSIO 81042空白基质中均未检测到目标分析物峰（m/z 145.04996），表明方法选择性良好。线性方面，在20–3200 ng/mL浓度范围内，校准曲线相关系数（R²）超过0.99，线性方程为Y=0.5462+0.02017X，R²=0.9978。灵敏度方面，检测限（LOD）为5 ng/mL，定量限（LOQ）为15 ng/mL，该LOQ值通过基质加标实验进一步验证（RSD=11.00%，回收率=85.87%），灵敏度比此前报道的方法高出数倍。基质效应方面，ME值为-0.519%，表明所建立的方法基质效应可忽略不计，样品前处理方案有效最小化了真菌降解体系对AA的基质干扰。准确度和精密度方面，在低（40 ng/mL）、中（200 ng/mL）、高（2000 ng/mL）三个浓度水平下，回收率分别为100.16%、89.32%和104.19%，日内RSD为3.55%–7.39%，日间RSD为7.32%–8.50%，均满足验证要求。稳定性方面，在-20°C和-80°C三次冻融循环以及4°C、-20°C和-80°C储存7天和14天的条件下，RSD值均低于15%，回收率保持在合理范围内。过滤回收率方面，在20、200和2000 ng/mL三个加标水平下，两步0.22 μm滤膜过滤的回收率范围为92.08%–98.68%，表明目标分析物损失可忽略不计。

实际应用结果：将验证后的LC-HRMS方法应用于Cladosporium oxysporum SCSIO 81042对PBA-PU塑料粉末的12天降解实验。AA在样品中被成功定性鉴定，其保留时间和产物离子谱图与AA标准品高度一致，满足定性鉴定标准。定量结果显示，培养液中AA的平均浓度分别为：第3天18.20 μg/mL、第5天23.50 μg/mL、第7天13.67 μg/mL、第10天8.72 μg/mL、第12天1.89 μg/mL，RSD值均低于20%。结果表明AA含量随培养时间增加而升高，在第5天达到峰值后逐渐下降，至第12天AA几乎被完全消耗。这一变化趋势反映了真菌在前五天快速生长、增强塑料分解能力的过程；随着培养基中营养物质减少，真菌生长减缓，并开始利用AA作为碳源。已有研究广泛记载了AA的代谢转化途径，包括从己二酰辅酶A转化为3-氧代己二酰辅酶A，进而转化为琥珀酰辅酶A或乙酰辅酶A，进入三羧酸（TCA）循环产生能量。

五、讨论与结论

讨论部分指出，所建立的简化两步提取方案充分利用了甲醇的特性：高稀释倍数（100倍）降低了共提取基质组分的绝对浓度，甲醇沉淀有效去除蛋白质，差异溶解性实现了AA与无机盐的分离。与传统三重四极杆LC-MS/MS不同，Q Exactive Focus Orbitrap高分辨质谱仪提供的高质量分辨率和PRM模式进一步提高了对AA的选择性，使该平台在复杂真菌培养基质中的定量分析更加可靠。与已报道的AA检测方法相比，本方法在宽线性范围（20–3200 ng/mL，R2=0.9978）、低LOD（5 ng/mL）和LOQ（15 ng/mL）、满意的日内和日间精密度以及良好准确度方面均达到或优于此前报道的方法水平。

研究结论指出，本研究开发并验证了一种稳健、无需衍生化的LC-HRMS方法，专门用于复杂真菌微塑料降解体系中AA的定量分析。通过系统优化色谱和质谱参数，该方法表现出优异的选择性、灵敏度和重现性，有效克服了真菌培养基的显著基质干扰。全面验证确认了优异的线性、低LOD和LOQ、高精密度和准确度以及各种储存条件下的可靠稳定性。将该方法应用于实际真菌降解样品，能够灵敏、准确地监测PBA-PU解聚过程中AA的释放，为阐明降解途径提供了有力工具。这项工作建立了专门的分析平台，填补了微塑料生物降解研究中的关键方法学空白，为未来涉及真菌降解可生物降解聚合物的机理和环境研究提供了可靠基础。虽然该方法能够定量评估降解单体的含量，但降解速率的确定仍需借助失重法等方法实现。未来研究将把失重法与所建立的LC-HRMS方法相结合，系统研究Cladosporium oxysporum 81042在不同浓度下的降解效率，从而更全面地理解真菌介导的塑料降解过程。此外，当前依赖甲醇稀释和沉淀的前处理方法对于真菌培养样品简单高效，但对于土壤淋溶液等更复杂的基质，其净化能力有限，建议在未来的研究中采用固相萃取（SPE）进行样品净化，以扩展该分析方法的应用范围。