创新方法揭示受体控制G蛋白状态平衡的机制

《Advanced Science》：Innovative Approach Reveals How Receptors Control G Protein State Equilibria

　　

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）构成最大的药物靶点家族，通过异三聚体G蛋白发挥作用。激动剂结合的GPCR促进G蛋白释放GDP，使其在GTP结合后激活。研究人员采用创新工具分析了这一过程，这些工具能够检测天然Gi蛋白的主要状态：GDP结合态、开放的核苷酸游离态和活性GTP结合态。研究表明，受体激活增加了开放态Gi蛋白的数量，与失活Gi蛋白释放GDP一致。研究人员还观察到，活性受体能从活性Gi蛋白上释放GTP，从而回到失活的开放状态。与此一致，受体激活还促进了细胞中从GTP结合态形成Gαβγ复合物，与受体-G蛋白三元复合物的形成一致。这些数据提示，GPCR激活时产生的活性GTP结合形式的量可受受体诱导的GTP释放所控制。这种依赖于受体亚型的G蛋白状态平衡的调控可能影响偶联效率。这些数据揭示了受体依赖的G蛋白状态平衡，并将GTP释放确定为一种额外的、环境依赖的调控点，可塑造表观偶联效率。

G蛋白偶联受体（GPCRs）是人体中最大的膜受体家族，也是最重要的药物靶标，约三分之一的上市药物通过作用于该家族受体而发挥疗效。经典模型认为，激动剂激活GPCR后，受体作为鸟嘌呤核苷酸交换因子催化G蛋白α亚基释放GDP，进而结合GTP形成活性GTP结合态，使Gα-GTP与Gβγ分离并分别调控下游效应器，随后GTP被水解为GDP，G蛋白恢复异三聚体状态。然而，G蛋白实际存在三种主要构象：失活的GDP结合态、无核苷酸的开放态（Gα^OPEN）和活性GTP结合态（Gα^GTP）。现有检测方法大多只测量GTP类似物结合量，无法区分并追踪这些构象之间的动态平衡。早期生化研究曾提示受体可能促进已结合的GTP类似物释放，即“反向模式”耦合，但这一现象缺乏直接的构象证据，其生理意义也未得到充分认识。因此，研究人员旨在建立能够直接监测内源G蛋白构象状态的工具，进而解析受体对G蛋白状态平衡的调控机制。

研究人员开发了基于时间分辨荧光共振能量转移（trFRET）的构象传感器，选择性检测内源Gi蛋白的开放态与GTP结合态。利用这些工具，他们发现在受体激活过程中，受体不仅能催化GDP释放，还能从已结合GTP的活性Gi蛋白上释放GTP，使G蛋白重新进入开放态，从而限制GTP结合形式的数量。进一步在细胞中证实，受体可稳定A-R*-Gα^OPENGβγ三元复合物，促进Gβγ重新与Gα结合。该研究揭示了受体依赖的G蛋白状态平衡，并指出GTP释放是一个额外的、依赖上下文环境的调控节点，可影响表观偶联效率。相关成果发表在《Advanced Science》。

研究中使用的关键技术方法（不超过250字）：研究人员设计并验证了多个特异性结合物：一个选择性识别Gαi-GTPγS活性构象的肽段KB1753DS（与荧光受体XL665偶联），以及单克隆抗体Ab13、Ab26、Ab39和Ab31，其中Ab26偏好结合GDP态与开放态，Ab13与Ab39无构象选择性，Ab31识别Gβγ复合物。将抗体标记trFRET供体Lumi4-Tb或受体d2后，构建了两种传感器：检测Gαi-GTPγS状态的肽段-XL665/Ab13-Tb组合，以及检测Gαi开放态的Ab26-d2/Ab39-Tb组合。另开发了异三聚体传感器Ab39-d2/Ab31-Tb用于细胞中跟踪Gα与Gβγ的关联。研究使用纯化重组蛋白、过表达不同受体的商品化膜制剂（HEK293、CHO-K1、CHEM-1细胞系）以及软透化的HEK293细胞进行检测。

研究结果部分如下：

2.1 创新工具检测Gαi构象状态：通过纯化的Gαi1-GDP和Gαi1β1γ2异三聚体，确认肽段KB1753DS特异性结合GTPγS构象，抗体Ab26选择性识别GDP态与开放态，Ab13和Ab39对构象无偏好，并测定了各自的亲和力。

2.2 检测内源Gi蛋白构象状态的FRET传感器：将上述结合物配对后，肽段-XL665/Ab13-Tb可灵敏检测膜制剂中内源Gαi的GTPγS态，Ab26-d2/Ab39-Tb可特异检测Gαi开放态，并通过Apyrase处理进一步验证开放态信号。

2.3 生物传感器检测特定Gαi亚型：在HEK293细胞中分别表达TST/Flag标记的Gα亚型，测得Ab13主要识别Gαi1和Gαi3，Ab39对Gαi1具有选择性，Ab26偏好Gαi1和Gαi3，肽段识别Gαi1/2/3。因此传感器可检测不同Gi/o亚型。

2.4 传感器检测α-螺旋域和Ras域的相对重定向：通过竞争实验、突变分析和序列比对，确定Ab13与Ab39识别的表位位于α-螺旋结构域，Ab26结合在GTPase结构域与α-螺旋结构域之间的连接区域，表明传感器监测核苷酸交换过程中两个结构域的相对运动，与开放态构象一致。

2.5 监测激动剂诱导的Gi开放状态：在表达人δ-阿片受体（DOP）的膜上，激动剂SNC162降低Gαi-GTPγS传感器信号，同时升高开放态传感器信号；拮抗剂纳曲吲哚则可逆转该效应。无论G蛋白预先负载GDP还是GTPγS，受体激活均能稳定开放态，提示受体可直接诱导核苷酸释放。

2.6 激动剂诱导Gi开放状态的相对定量：通过不同GTPγS浓度下的检测，计算受体介导的Gα^OPEN比例随GTPγS浓度升高而增加，最高约占可检测Gi蛋白总量的60%，表明激动剂能显著促进G蛋白进入开放态。

2.7 不同G蛋白偶联受体的药理学表征：利用该传感器对DOR、MOR、KOR及多种Gi偶联受体进行激动剂/拮抗剂剂量反应测试，得到的pEC50/pIC50与经典[³⁵S]GTPγS结合测定结果高度相关；并对DOR部分激动剂、反向激动剂等进行了区分。不同受体诱导的Gα^OPEN最大比例约在20%–40%之间，而Gs偶联的GLP-1受体无信号。

2.8 细胞中可视化G蛋白状态平衡与三元复合物稳定：在软透化的HEK293细胞中，DAMGO诱导GTPγS从Gα上释放（FRET信号下降）。新开发的异三聚体传感器显示，在10 nM GTPγS存在下，DAMGO反而增加Gα与Gβγ的trFRET信号，说明受体通过释放GTP将Gβγ重新招募到Gα开放态上，稳定了高亲和力的受体-G蛋白三元复合物。

总结讨论部分：研究人员指出，由GPCR激活产生的GTP结合态G蛋白数量并非仅由GDP/GTP交换决定，而是受三个过程调控：GTP结合到开放态、GTPase介导的水解（由RGS蛋白加速），以及受体与GTP结合态结合并诱导GTP释放从而重新形成开放态。第三种“反向”机制可在强烈或持续的受体激活下限制活性G蛋白的水平，可能影响最大细胞反应。该观点与近期使用放射性标记脉冲-追踪实验得到的结果一致，并强调了直接追踪G蛋白构象平衡的重要性。

研究结论为：这些数据揭示了受体依赖的G蛋白状态平衡，并确定GTP释放是一个额外的、环境依赖的控制点，能够塑造表观偶联效率。