膜靶向tdTomato在七种转基因小鼠品系中实现中枢与周围神经系统髓鞘红色荧光标记并兼容绿色光谱功能成像

《GLIA》：Red Fluorescent Labeling of Myelin by Membrane-Targeted tdTomato in Transgenic Mouse Lines

　　

髓鞘（myelin）是一种高度复杂的膜性结构，分别由中枢神经系统（central nervous system, CNS）和周围神经系统（peripheral nervous system, PNS）中的少突胶质细胞（oligodendrocytes）或施万细胞（Schwann cells）包绕轴突形成。荧光标记（fluorescent labeling）广泛用于研究髓鞘的结构和动力学。将结构与功能成像相结合需要用红色荧光标记髓鞘，因为许多功能传感器，包括Ca²⁺指示剂（Ca²⁺ indicators）和遗传编码代谢物传感器（genetically encoded metabolite sensors），在绿色光谱范围内发出荧光。然而，能够在体内（in vivo）对髓鞘化细胞及其髓鞘进行红色荧光标记的工具仍然有限。在此，研究人员生成了一组七种转基因小鼠品系，在遍及神经系统的髓鞘化少突胶质细胞和施万细胞中表达红色荧光蛋白tdTomato的膜靶向变体。这些小鼠品系提供多种表达模式，从髓鞘广泛标记到相当稀疏的表达，后者能够可视化单个少突胶质细胞及其相关髓鞘。在周围神经系统中，坐骨神经（sciatic nerves）中的荧光模式表明tdTomato主要定位于非致密髓鞘区室（non-compact myelin compartments），包括内舌（inner tongues）和外舌（outer tongues）、旁结环（paranodal loops）以及Schmidt-Lanterman切迹（Schmidt-Lanterman incisures）。总之，研究人员的工作提供了一组以红色荧光标记髓鞘的新型小鼠品系，这些品系与绿色光谱范围内的多种成像模式兼容，能够实现整合的结构和功能成像。

髓鞘（myelin）是由少突胶质细胞（oligodendrocytes）和施万细胞（Schwann cells）分别在中枢神经系统（central nervous system, CNS）与周围神经系统（peripheral nervous system, PNS）中包绕轴突形成的高度复杂膜性结构，支持跳跃式冲动传导，并参与运动、感觉和认知功能。髓鞘形成涉及增殖、迁移、分化以及轴突接触、径向和纵向扩展等过程；成熟髓鞘虽以致密髓鞘（compact myelin）为主，但仍保留近轴突内层和远轴突外层等非致密、代谢活跃的髓鞘亚区室，并通过胞质通道相连，在PNS中包括Schmidt-Lanterman切迹（Schmidt-Lanterman incisures）。少突胶质细胞存在区域异质性，且髓鞘化具有可塑性，成年期活动可触发髓鞘形成；脱髓鞘、髓鞘发育不良或少突胶质细胞疾病相关状态是髓鞘相关疾病的重要病理特征。因此，髓鞘生物学研究依赖能够测量髓鞘存在与形态、研究轴突-髓鞘分子和代谢相互作用的工具。已有转基因小鼠品系多以绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）标记少突胶质细胞和/或髓鞘，例如由蛋白脂蛋白（proteolipid protein, Plp1）启动子、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白（myelin-associated oligodendrocyte basic protein, Mobp）启动子、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, Mbp）启动子或2′-3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶（2′-3′-cyclic nucleotide 3′-phosphodiesterase, Cnp）启动子驱动；部分品系通过CAAX膜锚定序列（CAAX membrane anchor domain）将EGFP定位于质膜。但EGFP荧光位于绿色光谱范围，与绿色荧光Ca²⁺传感器和多数遗传编码代谢物传感器光谱重叠，难以同时进行结构和功能成像。已有红色荧光品系中，Plp1-DsRed主要标记少突胶质细胞胞体，髓鞘信号有限；Plp1-CreERT2与tdTomato报告基因组合可实现红色标记，但需要杂交和tamoxifen处理。因此，研究人员旨在建立不依赖Cre、单转基因、膜靶向红色荧光标记髓鞘的小鼠品系，并使其兼容绿色光谱功能传感器。研究人员利用Cnp启动子驱动CAAX膜锚定的tdTomato，生成七种转基因小鼠品系CNPMTO-A、C、D、E、F、H、I，系统分析其在CNS和PNS的表达模式、髓鞘定位、单细胞形态及与功能传感器的兼容性，结论是这些品系可在红色光谱范围稳定、特异标记髓鞘化胶质细胞和髓鞘，并可与蓝-绿-黄光谱功能成像结合，为髓鞘结构、动力学、轴突-胶质代谢互作及髓鞘相关疾病研究提供新工具。

关键技术方法概括：研究人员将Cnp启动子驱动的CAAX膜锚定tdTomato转基因构建体经原核显微注射导入C57BL/6N小鼠卵母细胞，获得并维持七个品系，品系注册于Mouse Genome Informatics（MGI）和European Mouse Mutant Archive（EMMA）；以基因组PCR进行基因分型；对54至327天龄成年小鼠进行灌流固定，取脑、视神经和坐骨神经；采用全脑切片扫描、免疫荧光共定位、共聚焦与Airyscan成像、免疫金标记透射电镜、坐骨神经撕开纤维制备及CNPMTO-A与ThyAT品系杂交双转基因成像。ThyAT品系为B6-Tg(Thy1.2-ATeam1.03YEMK)AJhi（MGI:5882597；Trevisiol et al. 2017），表达神经元ATP传感器ATeam1.03YEMK。

结果部分：第一，tdTomato表达模式。通过全脑矢状切片扫描发现，七个品系均在脑髓鞘中表达tdTomato，但模式不同：CNPMTO-A、E、I为广泛表达，许多少突胶质细胞和髓鞘结构强标记；CNPMTO-D、F、H为斑片状表达，少突胶质细胞成簇表达；CNPMTO-C为稀疏表达，仅少数细胞及其髓鞘被标记。该差异提供从群体水平到单细胞分辨率的选择。第二，MBP共定位定量。用抗MBP抗体染色并量化tdTomato与MBP双阳性面积占MBP免疫阳性面积比例，CNPMTO-C在所有脑区最低；CNPMTO-A、E、I在多数脑区达到60%至80%的MBP免疫阳性面积标记，说明高表达品系可标记大部分髓鞘，稀疏品系则提供选择性标记。第三，少突胶质细胞与髓鞘定位。共聚焦成像显示tdTomato沿轴突定位于髓鞘中；与CNP或MBP共免疫标记显示，tdTomato出现在CNP免疫阳性少突胶质细胞的胞体、突起及髓鞘中，部分CNP阳性细胞不表达tdTomato；MBP共标显示荧光位于轴突两侧，包裹的轴突本身无荧光，少突胶质细胞连接胞体与髓鞘的主要突起可被tdTomato标记但不被MBP染色。第四，CNPMTO-C单细胞形态。利用稀疏标记进行3D重建，皮质和胼胝体中分别约86%和77%的tdTomato标记少突胶质细胞彼此清晰分离；每个少突胶质细胞平均分别有35和41个结间段；结间段长度多在30至90 μm，约10%超过100 μm，表明该品系适合在红色光谱范围研究和量化单个少突胶质细胞形态。第五，视神经及免疫金电镜定位。七个品系的视神经全组织成像均显示髓鞘标记，CNPMTO-A、E、I标记大部分髓鞘，CNPMTO-C仅少数少突胶质细胞表达，可成像单细胞及其髓鞘；对CNPMTO-I视神经超薄横切面进行免疫金标记透射电镜，多数金颗粒位于髓鞘的胞质区室，少数位于致密髓鞘，提示tdTomato主要位于内舌、外舌及打断致密髓鞘的电子透明胞质裂隙。第六，坐骨神经与PNS定位。坐骨神经全组织、横切和撕开纤维分析显示，CNPMTO-A、E、I多数纤维广泛表达，其中CNPMTO-E整体较弱；CNPMTO-D、H呈斑片状；CNPMTO-C、F很少或无纤维标记。撕开纤维显示tdTomato富集于富含胞质的施万细胞结构而非致密髓鞘，包括Schmidt-Lanterman切迹、郎飞结以及内舌和外舌；横切面中每个轴突周围可见两个荧光环，可能对应内舌和外舌。第七，双转基因功能成像。将CNPMTO-A与ThyAT杂交，ATeam1.03YEMK由mseCFP和cp173mVenus组成，分别在蓝色和黄色光谱发射；在视神经中，轴突由黄色mVenus荧光标记，周围髓鞘由膜锚定tdTomato红色荧光标记；在皮质中，可区分无tdTomato标记髓鞘的神经元突起、无ATP传感器轴突的红色髓鞘以及同时具有轴突ATP传感器和髓鞘tdTomato的有髓纤维，表明CNPMTO品系兼容蓝-绿-黄色光谱功能传感器。

讨论部分总结：荧光显微成像已革新神经系统研究，细胞类型特异性荧光蛋白可研究结构和结构动力学，功能报告基因可评估Ca²⁺或代谢物动态。但许多功能传感器位于绿/黄色光谱范围，与EGFP类结构报告基因同时成像受限。研究人员通过CAAX膜锚定tdTomato在Cnp启动子下表达，获得七个在CNS和PNS中稳健、特异标记髓鞘化胶质细胞的品系。膜锚定EGFP此前已用于小鼠和斑马鱼髓鞘标记，CAAX序列也用于将tdTomato定位至斑马鱼巨噬细胞质膜，并已用于AAV介导的少突胶质细胞膜靶向tdTomato；但AAV转导效率可变，而转基因表达稳定、可重复，适合长期成像和与功能传感器组合。七个品系表达模式差异可能源于转基因整合位点和拷贝数差异，提供互补工具：CNPMTO-A广泛覆盖多数髓鞘，适用于病理中髓鞘丢失研究；CNPMTO-C稀疏表达提供单细胞分辨率，可描绘单个少突胶质细胞及其髓鞘并量化结间段长度。除髓鞘化胶质细胞外未检测到其他神经细胞类型表达，但不能完全排除少数细胞低水平异位表达；未观察到转基因动物比例偏低、母源与父源传递表达模式差异、常规笼养行为或总体健康异常，也未观察到tdTomato表达的明显细胞毒性，所有品系至少繁殖五代且不同世代间未见品系内差异。tdTomato主要位于非致密髓鞘和髓鞘内通道，较少位于致密髓鞘，这可能对需要明确标记致密髓鞘的实验构成不足；但膜锚定EGFP品系也呈类似定位，且Cnp-mEGFP品系已被广泛使用，因此该定位模式未必普遍妨碍应用。与Plp1或Mobp驱动胞质EGFP、Mbp或Cnp驱动膜锚定EGFP的品系相比，CNPMTO的红色荧光克服了与绿色至黄色功能传感器的光谱限制；与Plp1-DsRed相比，CNPMTO髓鞘标记更清晰；与Cre或CreERT2依赖的红色报告策略相比，CNPMTO无需复杂杂交，也不需tamoxifen，并可避免与条件性基因删除策略冲突。结论翻译：总之，研究人员提出了一种用于体内、离体和体外实验中对髓鞘化胶质细胞及其髓鞘成像的新型多功能工具。CNPMTO小鼠品系允许用红色荧光在CNS和PNS中可视化髓鞘结构，为在体内研究髓鞘的结构和功能方面提供平台，尤其可与神经元或胶质细胞中表达的绿色荧光、遗传编码功能传感器联合使用。这些品系有望推动对髓鞘结构、动力学和可塑性、轴突-胶质代谢相互作用以及髓鞘相关疾病病理生理学的理解。