《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Inhibition of Cerebellar Dentate Nucleus-Zona Incerta Glutamatergic Circuit Improves Sleep Disturbances in Chronic Temporal Lobe Epilepsy Model
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背景：慢性颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）患者常经历多种睡眠障碍，其特征为睡眠持续时间缩短、睡眠阶段减少及睡眠模式紊乱。近期研究已鉴定出腹侧未定带（zona incerta, ZI）中一群对促进睡眠具有重要作用的γ-氨基丁酸（
背景：慢性颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）患者常经历多种睡眠障碍，其特征为睡眠持续时间缩短、睡眠阶段减少及睡眠模式紊乱。近期研究已鉴定出腹侧未定带（zona incerta, ZI）中一群对促进睡眠具有重要作用的γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）能神经元，并发现一条连接小脑齿状核（cerebellar dentate nucleus, CDN）与ZI的神经通路。然而，该回路在调节睡眠模式中的确切作用仍未得到充分理解。方法：本研究采用解剖学、化学遗传学（chemogenetics）、光遗传学（optogenetics）及免疫荧光染色（immunofluorescence staining）技术，探究CDN-ZI回路改善TLE相关睡眠障碍的潜力。结果：研究人员的发现表明，毛果芸香碱处理小鼠表现出显著的睡眠碎片化和睡眠持续时间缩短，尤其在非快速眼动（non-rapid eye movement, NREM）睡眠期间。通过采用光遗传学和化学遗传学方法靶向CDN谷氨酸能神经元，研究人员观察到毛果芸香碱处理小鼠的睡眠碎片化减少、总睡眠持续时间增加及睡眠质量增强。通过光遗传学和化学遗传学方法抑制CDN-ZI谷氨酸能回路，可显著改善TLE后的睡眠障碍。结论：靶向CDN-ZI谷氨酸能回路代表一种有前景的治疗策略，用于解决慢性TLE所致睡眠障碍。
慢性颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）患者常合并多种睡眠障碍，表现为睡眠持续时间减少、睡眠阶段减少及睡眠模式紊乱；癫痫与睡眠障碍之间存在双向加重关系，癫痫及其治疗可破坏正常睡眠结构，睡眠紊乱又可能影响癫痫控制。TLE相关睡眠障碍以夜间睡眠时间缩短、睡眠阶段减少或缺失、睡眠碎片化为特征，并促进认知功能障碍、情绪障碍及可能的癫痫发作频率增加。尽管临床意义明确，有效靶向干预仍有限，因此需要新策略。小脑日益被认为参与睡眠障碍；海马与小脑在非快速眼动（non-rapid eye movement, NREM）和快速眼动（rapid eye movement, REM）睡眠中相互作用；小脑接受组胺能、5-羟色胺能、去甲肾上腺素能及orexin/hypocretin能等调控输入；小脑输出均经深部小脑核，小脑齿状核（cerebellar dentate nucleus, CDN）为人类最大深部小脑核，主要含谷氨酸能投射神经元，占其神经元80%以上。未定带（zona incerta, ZI）位于丘脑下丘脑区，主要为抑制性γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）能神经元；腹侧ZI中LHX6表达GABA能神经元促进睡眠，激活可延长睡眠，抑制则抑制睡眠。CDN谷氨酸能神经元向下游投射至ZI。研究人员因此假设CDN-ZI谷氨酸能回路参与慢性TLE睡眠障碍，并开展研究。研究结论：抑制CDN-ZI谷氨酸能回路可显著改善TLE后睡眠碎片化、增加总睡眠时间和NREM睡眠、提高睡眠质量；靶向该回路是治疗慢性TLE相关睡眠障碍的有前景策略。意义：从回路水平揭示CDN-ZI对TLE睡眠的选择性调节，为临床TLE睡眠管理提供生物学依据。
关键技术与方法：研究使用C57BL/6J成年雄性小鼠（8–10周，购自空军军医大学实验动物中心）。采用锂-毛果芸香碱诱导慢性TLE模型，以视频-EEG-EMG记录和Lunion Stage软件进行睡眠-觉醒分期。通过脑立体定位注射腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）在CDN或CDN-ZI回路中表达抑制性化学遗传受体hM4D(Gi)、光遗传学抑制蛋白eNpHR3.0或对照，并结合氯氮平N-氧化物（clozapine N-oxide, CNO；1 mg/kg）腹腔注射和589 nm黄光（约10 mW/mm
2，30 s开/30 s关）刺激。采用免疫荧光染色检测CaMKIIα和Fos表达，并利用AAV2/2-CaMKIIα-EYFP顺行示踪验证CDN下游投射及CDN-ZI回路。
主要研究结果：
3.1 毛果芸香碱处理小鼠表现出显著睡眠障碍。研究人员在毛果芸香碱建模4周后进行连续EEG/EMG分析。模型诱导成功率73.46%（72/98），存活动物出现自发性反复发作（spontaneous recurrent seizures, SRS），第4周稳定。与对照组相比，模型组总睡眠时间减少，短觉醒次数增加，每小时NREM片段数增加，清醒时间延长，NREM睡眠时间减少，REM睡眠时间无显著变化，提示睡眠碎片化和睡眠质量下降。觉醒频率与SRS频率及持续时间相关；CDN中Fos表达显著升高，提示CDN在慢性癫痫中参与。
3.2 化学遗传学抑制CDN谷氨酸能神经元改善睡眠障碍。研究人员在双侧CDN注射hM4D(Gi)或mCherry病毒，给予盐水或CNO，连续7天记录。与hM4D+盐水组相比，hM4D+CNO组总睡眠时间增加，每小时觉醒次数和NREM片段数减少，清醒时间缩短，NREM睡眠时间延长，REM无显著变化。该抑制未显著减少惊厥发作频率或单次持续时间。停止抑制3天后，总睡眠时间、NREM质量和碎片化改善仍持续。
3.3 光遗传学抑制CDN谷氨酸能神经元改善睡眠障碍。研究人员在CDN表达eNpHR3.0或EYFP并植入光纤，给予或不给589 nm黄光，连续7天。eNpHR+黄光组较eNpHR+无光组总睡眠时间增加，觉醒/小时和NREM片段/小时减少，清醒时间缩短，NREM睡眠延长，REM无差异。对惊厥发作频率和持续时间无显著影响。停止3天后改善仍维持。
3.4 CDN下游投射区域及CDN-ZI谷氨酸能回路验证。研究人员将AAV2/2-CaMKIIα-EYFP顺行示踪病毒注入CDN，1月后切片观察。绿色荧光标记终末分布于VPL、VM、VPM、ZI、PR、RPF等区域，ZI分布密集；约26.5%的CDN谷氨酸能神经元投射至ZI，且这些投射神经元几乎均为谷氨酸能，确认CDN-ZI谷氨酸能回路存在。
3.5 化学遗传学抑制CDN-ZI谷氨酸能回路改善TLE后睡眠障碍。研究人员在CDN注射DIO-hM4D(Gi)或对照，ZI注射retro-rAAV-hSyn-Cre，CNO处理后记录。与hM4D+盐水组相比，hM4D+CNO组总睡眠时间增加，觉醒/小时和NREM片段/小时减少，清醒时间缩短，NREM睡眠延长，REM无显著变化。短期抑制后1天也改善睡眠连续性。
3.6 光遗传学抑制CDN-ZI谷氨酸能回路改善TLE后睡眠障碍。研究人员在CDN注射eNpHR-EYFP或EYFP，光纤置于ZI，给予黄光。eNpHR+黄光组较eNpHR+无光组总睡眠时间增加，觉醒/小时和片段/小时减少，清醒时间缩短，NREM睡眠延长，REM无显著变化。短期1天后效果一致。
讨论与结论：讨论指出，癫痫患者常伴严重睡眠障碍，睡眠碎片化可加重癫痫控制；TLE模型主要表现为NREM碎片化、觉醒增加、慢波活动减少、睡眠纺锤波密度降低，REM比例变化通常不如NREM显著。本研究相关性分析提示觉醒频率与癫痫发作频率和持续时间相关，NREM碎片化是癫痫活动与睡眠障碍之间的关键环节；干预CDN-ZI通路恢复NREM连续性，可能减少发作间期放电引起的觉醒系统激活，提示针对CDN-ZI谷氨酸通路的抑制策略可能特别适合TLE相关NREM维持障碍。研究确认CDN-ZI谷氨酸能回路存在和功能意义，抑制CDN可能降低ZI的兴奋性谷氨酸传递，增加GABA浓度，从而促进睡眠。小脑参与睡眠-觉醒转换，深部小脑核输出至多个丘脑核，ZI是介导小脑影响睡眠的关键下游。局限性：仅使用雄性小鼠；未观察到CDN或CDN-ZI抑制显著减少癫痫频率或持续时间，睡眠促进作用可能独立于直接调节癫痫发生；需在不同癫痫模型和长期操控中验证。研究结论翻译：靶向CDN-ZI谷氨酸能回路代表一种有望用于解决慢性TLE所致睡眠障碍的治疗策略；研究确立CDN-ZI谷氨酸能通路为慢性TLE背景下睡眠的关键调节者，靶向抑制该回路为缓解该疾病标志性睡眠障碍提供了新颖且有前景的治疗途径。
