肽偶联聚集诱导发光（AIE）荧光团与蛋白质结合的首个溶液NMR结构：hPin1-WW结构域识别与荧光直接读出机制

《RSC Chemical Biology》：Solution structure of a peptide-conjugated aggregation-induced-emission (AIE) fluorophore bound to a proteinOpen Access

在此，研究人员提出一类基于芳香硫醚且具有聚集诱导发光（aggregation-induced emission, AIE）性质的肽偶联荧光团，用于小蛋白的特异性识别，并报道首个特异性结合于蛋白质的AIE配体的溶液核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）结构。以hPin1-WW结构域作为模型蛋白进行结合导致显著荧光增加，使这些AIE-肽荧光团适合作为特异性蛋白相互作用的直接读出探针。研究人员阐明了自身荧光和蛋白结合性质随肽长度和荧光团浓度的变化。虽然带两条偶联肽的AIE荧光团在蛋白结合时显示增强的荧光增加，但单臂衍生物使研究人员能够解析游离AIE-肽及其复合物的结构。在蛋白不存在时，AIE-肽偶联物呈卷曲构象，但仍允许AIE核心的芳环旋转，因而导致低自身荧光。相反，AIE-肽在结合后展开，使hPin1-WW结构域能够与其肽识别序列相互作用。AIE核心的芳环与蛋白表面形成额外接触，限制其运动，从而导致观察到的荧光增加。

论文解读

研究背景与问题：自 Schmidt et al. 发现分子溶解的发光团也可发射约100年以来，Tang and co-workers 于2001年将聚集态发射命名为聚集诱导发光（aggregation-induced emission, AIE）。AIE发光来源于运动受限的发光团，通过抑制旋转和振动等分子运动实现辐射衰减。与传统荧光团不同，AIE发光团可从“off”切换到“on”状态，用于追踪结合事件并直接读出。芳香硫醚是通用AIE平台。此前，研究人员报道对称AIE活性配体可靶向癌症相关蛋白Taspase1或阻断蛋白酶p97中央孔，且结合可由发光响应追踪；分子建模提示AIE核与蛋白表面存在额外相互作用，可限制AIE运动并解释荧光增加，但AIE配体:蛋白复合物结构尚未发表。hPin1-WW是结构和生化表征充分的小蛋白结构域，已解析其apo形式及与CDC25、Tau、Smad、CPEB来源肽段结合的结构。研究人员将二臂或一臂AIE核与含磷酸苏氨酸–脯氨酸（pThr-Pro）识别基序的天然肽序列偶联，靶向hPin1-WW，以开展定量结合实验和结构研究，并检验AIE荧光开启是否源于AIE核与蛋白表面的特异接触。

研究开展、结论与意义：研究人员设计并合成了一类肽偶联AIE荧光团，含对二取代芳香邻苯二甲腈硫醚AIE核，带一个或两个炔基，通过铜(I)催化点击化学与含N端叠氮高丙氨酸（azido-homoalanine, Aha）的肽偶联。肽含hPin1-WW识别基序pThr-Pro，并以(Ala–Gly)_n（n = 0–3）调节连接子长度；还制备pThr突变为Thr的F25和pThr-Pro突变为Thr-Gly的F26作为非结合对照。结合hPin1-WW导致显著荧光增加，单臂F11使研究人员得以解析游离AIE-肽及其与hPin1-WW复合物的溶液NMR结构。结论是：游离AIE-肽呈卷曲构象，但仍允许至少一个AIE核芳环自由旋转，故自身荧光低；结合后AIE-肽展开，pThr-Pro被hPin1-WW识别，AIE核贴靠蛋白表面并通过F25、R14、M15等弱相互作用限制芳环运动，从而产生荧光“on”信号。该工作首次提供AIE配体结合蛋白的实验结构，证明AIE肽可作为蛋白结合的直接读出探针，并为设计多价肽超分子配体提供依据。

主要关键技术方法：研究人员采用Fmoc固相肽合成（solid-phase peptide synthesis, SPPS）制备含Aha的肽P1–P6，经Cu(I)催化点击化学与炔基化AIE核偶联，得到F11和F21–F26；以¹⁹F-NMR确认三氟乙酸（trifluoroacetate, TFA）离子交换为氯离子。用UV/Vis浊度和不同浓度自身荧光评估溶解度阈值。结合研究用¹⁵N标记hPin1-WW进行¹⁵N-HSQC滴定，以及AIE荧光滴定拟合解离常数（dissociation constant, K_D）和化学计量比。结构解析用核Overhauser效应光谱（nuclear Overhauser effect spectroscopy, NOESY）计算游离F11及F11:hPin1-WW复合物溶液结构，并用PISA分析界面。未涉及临床样本队列，模型蛋白为hPin1-WW结构域。

研究结果

Synthesis：研究人员通过Fmoc化学固相合成含Aha的肽，脱保护并HPLC纯化，再与带炔基的AIE核进行Cu(I)催化点击反应，得到单肽臂F11和二肽臂F21–F26；将TFA离子交换为氯离子，并以¹⁹F-NMR确认最终产物中无TFA。结论是获得了系列肽偶联AIE荧光团。

Solubility and auto-fluorescence properties：研究人员测量F11和F21–F26在水、HEPES或PBS缓冲液中的浊度和自身荧光。F11和F21–F24在高达200 μM时自身荧光增加较小，更高浓度出现显著增加；HEPES略优于PBS。突变对照F25和F26在最低浓度即自身荧光陡增，故未用于蛋白结合实验。蛋白结合研究在HEPES中用10–200 μM AIE-肽进行。结论是适合AIEE的探针需在水相中可溶且无蛋白时低自身荧光。

Solution structure of AIE-peptide F11 with one peptide arm：NOESY谱中观察到AIE核与所有氨基酸残基以及非相邻氨基酸之间的众多信号，提示紧凑结构。研究人员解析了单臂F11主构象的溶液NMR结构（PDB 29KP）。AIE核三芳环呈C形，末端三甲铵基藏于下方；肽臂在AIE核上方卷曲，脯氨酸与近端和中心芳环形成CH–π相互作用，带电荷的磷酸苏氨酸暴露于溶剂；DS-pThr肽键为cis。结构集合显示近端芳环旋转、三唑调整，中心环存在180°翻转。F21的NOESY模式与F11相似，提示类似卷曲结构，但对称性使结构计算不可行。F11约18%次要信号归因于含脯氨酸肽的cis–trans异构。芳环翻转估计在μs至较低ms时间尺度。结论是游离AIE-肽虽紧凑，仍保留AIE核部分芳环旋转，解释低自身荧光。

Aggregation-induced emission enhancement (AIEE) for the quantitative characterisation of protein binding via direct read-out：¹⁵N-HSQC滴定显示F11和F21–F24被hPin1-WW识别，K13–S16和Q33–E35发生明显信号位移，与无AIE核对照肽P0相同；NMR得到平均K_D为20–42 μM，P0为18.2 ± 0.2 μM。荧光滴定中，蛋白结合引起荧光增加，可拟合K_D和化学计量比n；F11预期n = 1，双肽臂F21–F24预期n = 2。低浓度下双肽臂探针得到良好曲线和低μM K_D,app，较高浓度因聚集使部分结合位点不可及，导致表观K_D增大。F11荧光幅度比双肽臂低5–9倍，但在100 μM内可按1:1拟合。连接子过短未阻碍结合，过长易聚集；短连接子更优。总体，AIE-肽在10–50 μM是蛋白结合定量直接读出探针。

NMR solution structure of F11 bound to hPin1-WW：研究人员解析F11与hPin1-WW的1:1复合物溶液结构（PDB 29KQ）。hPin1-WW鞍形折叠和中央三链β-折叠与apo及天然肽复合物无显著差异；F11不再卷曲，而披覆于β-折叠顶部，pThr-Pro与R17、Y23、W34区域结合，脯氨酸与Y23、W34形成CH–π。AIE核仍为C形，位于β-折叠表面，其芳环贡献最大埋藏表面积（buried surface area, BSA）为314.9 ?²。F25旋转进入C形中心，与中心及远端芳环形成face-to-edge π–π相互作用，限制AIE环旋转，解释荧光增加。R14以两种构象与C形AIE核发生阳离子–π作用；M15侧链向上指向三唑环，与AIE核形成额外接触。结论是AIE核与蛋白表面的特异弱相互作用限制其分子内运动，产生荧光“on”信号。

讨论与结论翻译：研究人员将AIE荧光团与靶向hPin1-WW结构域的肽偶联，作为通过直接读出即聚集诱导发光增强（aggregation-induced emission enhancement, AIEE）定量表征蛋白结合的模型系统，并展示了首个AIE配体结合蛋白的实验结构。点击化学偶联肽与AIE核可便捷地将AIE性质与多种肽配对。此前AIEE已用于分子镊子靶向p97和Taspase1，分子建模提示AIE核与蛋白表面接触。此处比较游离AIE-肽及其hPin1-WW复合物溶液结构：游离态呈卷曲构象，由脯氨酸与芳香AIE核心的分子内CH–π接触稳定，至少一个芳环仍可自由旋转，导致低自身荧光；结合后配体更伸展，使肽识别基序被hPin1-WW的脯氨酸结合口袋和磷酸结合环识别，AIE核贴靠蛋白表面，其特异接触限制分子内运动尤其是旋转，解释荧光增加。与天然对照肽P0相比，AIE-肽K_D略增，结合亲和力未改善，可能因游离态分子内接触需打破、AIE-肽需完全伸展以及结合态熵损失，且N端构象可能不同。F25/F26非结合肽高聚集且AIE核前体水溶性差，无法单独量化AIE核心对hPin1-WW结合的贡献。AIEE通常需要AIE荧光团与蛋白表面疏水斑块作用；多数球状折叠结构域具有疏水表面斑块，均匀高电荷表面不利。每个蛋白:AIE-肽系统需优化连接子长度；短连接子、带电残基和25–50 μM较低浓度有利于可靠结合数据。AIE-肽是荧光方法工具箱的补充，其二元“on”行为提供直接读出，但应避免可溶聚集体，并辅以正交、理想无标记结合分析。双肽臂F21–F24发射更强，更适合荧光结合实验；单臂F11的端基改造可能改善发射。未来可将不同AIE核心与肽组合，设计多价肽超分子配体用于多聚蛋白组装。