《Journal of Microbiological Methods》：A centrifuge-free, plate-based protocol to prepare chemically competent
Escherichia coli
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摘要经典的氯化钙法大肠杆菌转化方案可达到较高的转化效率，但通常依赖冷藏离心机、摇床和浊度控制等设备，而这些设备在教学实验室或资源有限的实验室中往往难以获得。我们开发了一种免离心、基于平板的工作流程来制备化学感受态大肠杆菌，并系统优化了其关键参数。在固体LB培养基上，DH5α在
摘要
经典的氯化钙法大肠杆菌转化方案可达到较高的转化效率，但通常依赖冷藏离心机、摇床和浊度控制等设备，而这些设备在教学实验室或资源有限的实验室中往往难以获得。我们开发了一种免离心、基于平板的工作流程来制备化学感受态大肠杆菌，并系统优化了其关键参数。在固体LB培养基上，DH5α在重新划线接种后2小时即进入指数生长期，并保持对数生长至6小时；在2小时收获可获得最高的感受态水平。缓冲液滴定实验表明，含0.25 M CaCl?和15%（v/v）甘油为最佳条件。热激后的复苏培养中，SOC培养基始终优于LB和0.5×LB。转化效率表现出对DNA剂量的依赖性：每100 μL反应体系中加入1–0.1 ng超螺旋质粒可获得最高效率。简化的CaCl?/甘油缓冲液可产生每微克DNA 10?–10?个转化子，足以满足常规克隆需求。温度依赖性实验表明，冰上DNA与细胞共孵育是唯一必需的低温步骤；感受态细胞可在室温下制备，且省略热激步骤不会降低转化效率。该简化方案降低了设备和时间要求，同时保持可重复的转化性能，非常适合教学实验室和其他资源有限的环境。
引言
细菌转化是指受体细胞从环境中摄取外源DNA的过程，从而导致基因型和表型的可遗传性变化。能够摄取外源DNA的细胞被称为"感受态细胞"。感受态可以是自然产生的（如肺炎链球菌或枯草芽孢杆菌），也可以通过化学或物理处理人工诱导。与天然感受态菌株不同，大肠杆菌本身并不具备自然摄取DNA的能力，因此人工感受态方案的开发对于分子克隆至关重要（Cohen等，1972）。1970年，Morton Mandel和Akiko Higa率先提出了一种可靠的方法，证明低温氯化钙处理可诱导大肠杆菌K-12菌株产生感受态，使其能够摄取噬菌体λ DNA而无需辅助噬菌体——这一发现奠定了至今仍在使用的人工化学转化方法的基础（Mandel和Higa，1970）。到了20世纪80年代初，更精细的方案相继问世。1983年，Douglas Hanahan通过优化转化缓冲液，使其包含二价阳离子（Ca2?、Mg2?、Mn2?、K?、Rb?）、二甲基亚砜（DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和六亚甲基四胺钴(III)，同时严格控制生长条件，引入了重大改进。这些增强措施将转化效率提高至每微克质粒DNA 10?–10? CFU（Hanahan，1983）。此后又有了进一步的改进。Inoue等人（1990）系统重新评估了转化条件，提出了后来被称为"SEM"（简易高效法）的方法。他们报告了使用DH5α、JM109和HB101等菌株可获得极高的效率（1–3×10? CFU/μg）；值得注意的是，这些细胞即使在液氮冷冻后仍能保持转化感受态（Inoue等，1990）。近年来，上述里程碑式的发展得到了进一步的拓展。Hanahan和Inoue的方法仍被广泛采用，在常规操作中通常可达到约10? CFU/μg；简化版本如TSS（转化储存液）和TSS-HI方案将转化效率进一步提升至约10? CFU/μg，同时提供了简化的制备流程（Chung等，1989）。与化学转化互补，物理方法也作为强大的替代方案应运而生。电穿孔技术——于20世纪80年代末开发——绕过了化学诱导，通过短暂的高电压脉冲引入DNA，显著提高了多种菌株的转化效率（Dower等，1988）。
在现有技术中，氯化钙（CaCl?）热激法仍然是学术实验室中最广泛用于大肠杆菌转化的方法之一。然而，在资源有限的环境（如中学或实验室基础设施受限的大学）中实施传统感受态细胞制备方案往往具有挑战性，因为这些方案需要专用设备，如温度可控摇床、分光光度计和冷藏离心机。为解决上述局限，我们开发了一种基于经典CaCl?法的简化、稳健且可重复的转化方案。具体而言，我们采用免离心、基于平板的培养策略来制备化学感受态大肠杆菌细胞，并系统优化了影响转化效率的关键实验变量。该简化方法已在我们的教学实验室中应用多年，始终获得可靠的结果，既适合基础研究，也适合教学应用。该方法已获中国专利授权（ZL 2022 11,228,360.8），进一步彰显了其新颖性和潜在应用价值。
章节片段
菌株与质粒
大肠杆菌DH5α、BL21和JM109被用作制备感受态细胞和质粒转化的受体菌株。细菌菌种常规在?80 °C、含30%（v/v）甘油的条件下冷冻保存。质粒pBG309和pUC19作为主要的转化底物。质粒pBG309（约4600 bp），编码绿色荧光蛋白（GFP）和氯霉素抗性基因，由中山大学陆永军博士慷慨提供（K?hler等，2000；Chen等，2006）。
平板生长动力学揭示2小时收获窗口可使化学感受态最大化
优化收获时间对于化学感受态至关重要，因为大肠杆菌通常在液体培养中早期至中期指数生长期最易转化（Hanahan，1983；Sambrook和Russell，2006）。为确定固体培养基上是否存在类似的窗口，我们在LB琼脂上定量分析了生长动力学。从过夜平板中取一段1–2 cm的菌苔，重新划线接种至新鲜LB平板，并在37 °C下培养设定的时间间隔（0、2、6、8、10、12、24小时）。在每个时间点，取三块平板……
讨论
本文所述基于平板的免离心工作流程在操作简便性与转化性能之间实现了实用平衡，转化效率达到每微克DNA 10?–10?个转化子的水平，同时消除了对冷藏离心、多组分缓冲液乃至热激步骤的依赖。对于常规克隆和教学实验室而言，这一性能水平通常已足够，从而满足了在资源受限或教学环境中开展质粒工作的目标。
结论
我们提出了一种免离心、基于平板的制备化学感受态大肠杆菌的方案，该方案简便、可重复，适合教学和 resource-limited 实验室使用。系统优化确定2小时平板再孵育窗口以及含0.25 M CaCl?和15%（v/v）甘油的缓冲液为最佳条件；SOC复苏培养优于LB培养基，每100 μL反应体系中加入1–0.1 ng DNA可最大化产量。基准测试表明，虽然CCMB80和简化CaCl?/甘油缓冲液可带来更高的……
CRediT作者贡献声明
罗静：构思。Sophia Hao Zheng：数据整理。张凤吉：形式分析。苗齐萱：软件。邹乐嫣：调查研究。轩晓燕：验证。王鹏：验证。郑华鑫：写作——审阅与编辑。
资金
本研究未获得来自公共、商业或非营利部门基金机构的任何特定资助。
利益冲突声明
作者声明不存在已知的竞争性经济利益关系或个人关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
作者感谢中山大学陆永军教授慷慨提供编码绿色荧光蛋白（GFP）和氯霉素抗性基因的质粒pBG309。
罗静|Sophia Hao Zheng|张凤吉|苗齐萱|邹乐嫣|轩晓燕|王鹏|郑华鑫
郑州大学基础医学院微生物学与免疫学系，郑州，450001，中国
