右美托咪定抑制腹侧被盖区GABA能神经元减轻小鼠镇静深度

《Brain and Behavior》：Dexmedetomidine Inhibition of GABA Neurons in the Ventral Tegmental Area Attenuates the Depth of Sedation in Mice

　　

摘要专业翻译 摘要 引言 右美托咪定（Dexmedetomidine）是一种镇静麻醉药，具有产生可唤醒性镇静状态的独特能力。然而，这种可唤醒性镇静背后的神经机制仍未完全阐明。既往研究提示腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）的多巴胺能神经元参与了该效应的介导，但其上游神经环路机制仍不清楚。此外，尽管VTA GABA能神经元对多巴胺能神经元具有强大的抑制作用，但其在右美托咪定诱导的可唤醒性镇静中的具体作用仍不明确。 方法 研究人员使用Vgat-Cre转基因小鼠研究VTA GABA能神经元在右美托咪定诱导的可唤醒性镇静中的作用。采用脑电图（electroencephalography, EEG）、光纤光度法（fiber photometry）、钙成像、GABA神经递质传感、化学遗传学操作及免疫组织化学等方法评估神经元活动、GABA能信号传导及对右美托咪定的行为学反应。 结果 使用钙指示剂GCaMP6m进行光纤光度记录显示，右美托咪定抑制了VTA GABA能神经元。使用GABA神经递质传感器iGABASnFR进行光纤光度记录表明，右美托咪定增加了VTA GABA能神经元的GABA能输入。化学遗传学操作结合EEG证明，激活VTA GABA能神经元加深了右美托咪定诱导的镇静深度，而抑制这些神经元则减轻了镇静深度。 结论 这些发现提示，右美托咪定增加了VTA GABA能神经元的GABA能输入并抑制其活动，这可能有助于其可唤醒性镇静效应。仍需进一步研究以确立该神经环路机制的因果关系。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

右美托咪定（Dexmedetomidine）是一种广泛用于临床的镇静剂，也是高选择性α₂-肾上腺素能受体激动剂。与其他多数镇静剂不同，其镇静效应具有易于唤醒的显著特征，因此被广泛应用于功能神经外科手术和重症监护病房（ICU），在这些场景中允许患者被唤醒的镇静状态具有重要的临床价值。然而，这种可唤醒性镇静背后的神经机制尚未被完全阐明。

蓝斑（locus coeruleus, LC）长期以来被认为是介导右美托咪定镇静效应的关键脑区。作为中枢神经系统去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）能神经元的主要来源，LC表达α₂-肾上腺素能受体，右美托咪定通过激活这些受体并经G蛋白偶联机制抑制LC神经元活动，从而减少全脑NE释放。由于LC-NE系统是重要的促觉醒系统，其被抑制为镇静效应提供了合理的机制解释。然而，仅抑制LC-NE系统并不能完全解释右美托咪定所产生的特征性可唤醒状态。

既往研究已证实，右美托咪定可激活腹侧被盖区（VTA）的多巴胺（dopamine, DA）能神经元，增加下游脑区（包括内侧前额叶皮层和伏隔核）的DA释放。VTA DA系统同样是觉醒的重要调节者，体内激活VTA DA神经元可促进小鼠觉醒，而抑制该系统则促进睡眠。激活VTA DA神经元可减弱右美托咪定诱导的镇静，而抑制这些神经元则增强其镇静效应。因此，右美托咪定除抑制LC-NE系统外，还可能调节VTA DA系统，其可唤醒性镇静的特性可能源于对参与镇静和觉醒的多个神经环路的协调作用。

鉴于中枢神经系统的复杂组织，其他神经元群体也可能参与这一可唤醒表型。VTA GABA能神经元是睡眠-觉醒状态的重要调节者，既往研究表明激活VTA GABA能神经元可加深异氟烷麻醉深度，促进小鼠睡眠，而其抑制则促进觉醒。重要的是，VTA GABA能神经元对VTA DA神经元具有强大的抑制性控制。然而，VTA GABA能神经元是否参与介导右美托咪定诱导的可唤醒性镇静仍属未知。因此，本研究旨在通过阐明潜在的神经机制，为开发允许易唤醒的更精准镇静药物提供理论靶点。

二、研究设计与技术方法

研究人员使用Vgat-Cre转基因小鼠（8–12周龄，购自美国杰克逊实验室）及C57BL/6J小鼠（购自中国南京集萃药康），所有实验经安徽医科大学动物伦理委员会批准（伦理批准号LLSC20210042）。右美托咪定给药剂量均为40 μg/kg。

研究采用的主要关键技术方法包括：①基于Cre-loxP系统的选择性AAV表达技术，将Cre依赖的AAV载体注入VTA，实现VTA GABA能神经元的细胞类型特异性转基因表达；②在体光纤光度法（fiber photometry），使用钙指示剂GCaMP6m监测VTA GABA能神经元的实时钙信号变化，并使用GABA神经递质传感器iGABASnFR监测体内GABA信号变化；③化学遗传学（chemogenetic）操作，通过注射Cre依赖的AAV-DIO-hM3Dq-mCherry（激活）或AAV-DIO-hM4Di-mCherry（抑制）实现对VTA GABA能神经元的选择性激活或抑制；④脑电图（EEG）记录，通过PowerLab和LabChart系统采集信号并计算功率谱密度，评估镇静深度；⑤免疫组织化学染色，使用酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）抗体标记VTA多巴胺能神经元以验证病毒表达的细胞特异性。

三、研究结果

3.1 右美托咪定抑制VTA GABA能神经元

研究人员将Cre依赖的AAV-EF1α-DIO-GCaMP6m注入Vgat-Cre小鼠的VTA，通过光纤光度法实时监测细胞内Ca²⁺信号变化。荧光成像证实GCaMP6m在VTA GABA能神经元中稳健表达，且与TH免疫染色共定位极少。光纤光度记录显示，腹腔注射生理盐水未显著改变GCaMP6m荧光信号；而全身给予右美托咪定诱导GCaMP6m荧光显著下降，并随镇静效应消退而部分恢复。定量分析证实两组间差异显著（Mann–Whitney U检验；生理盐水组0.17 ± 0.31 vs. 右美托咪定组?8.46 ± 1.07；U = 0，p = 0.008，n = 5）。该结果表明右美托咪定抑制VTA GABA能神经元活动。

3.2 右美托咪定增加VTA GABA能神经元的GABA能传递

研究人员将Cre依赖的AAV-DIO-iGABASnFR注入Vgat-Cre小鼠的VTA，通过光纤光度法实时监测体内GABA信号变化。腹腔注射生理盐水仅引起iGABASnFR荧光的微小变化；而右美托咪定给药则产生显著的GABA信号增加。定量分析证实两组间差异显著（非配对t检验；95%置信区间[CI]，11.49–20.97；生理盐水组?1.83 ± 0.75 vs. 右美托咪定组14.40 ± 1.99；t = 7.63，p < 0.001，n = 6）。该结果表明右美托咪定增加了VTA GABA能神经元的GABA能输入。

3.3 化学遗传学激活VTA GABA能神经元加深右美托咪定诱导的镇静深度

研究人员将Cre依赖的AAV-DIO-hM3Dq-mCherry或对照AAV-DIO-mCherry双侧注入Vgat-Cre小鼠的VTA。三周后，所有动物接受CNO（1 mg/kg，腹腔注射），30分钟后再给予右美托咪定（40 μg/kg，腹腔注射），同时进行EEG记录。与mCherry对照组相比，hM3Dq组表现出低频EEG活动的明显增加。尽管两组间总功率密度差异未达到统计学显著（双因素重复测量方差分析；F(1, 22) = 0.25，p = 0.62；n = 12），但δ频段功率在两组间差异显著（非配对t检验；95% CI，?12.79至?5.459；对照组57.95 ± 1.51 vs. hM3Dq组48.83 ± 0.92；t = 5.16，p < 0.0001；n = 12）。该结果表明化学遗传学激活VTA GABA能神经元加深了右美托咪定诱导的镇静深度。

3.4 化学遗传学抑制VTA GABA能神经元减轻右美托咪定诱导的镇静深度

研究人员将Cre依赖的AAV-DIO-hM4Di-mCherry双侧注入Vgat-Cre小鼠的VTA。三周后，所有动物接受CNO（1 mg/kg，腹腔注射），30分钟后再给予右美托咪定（40 μg/kg，腹腔注射），同时进行EEG记录。与对照组相比，hM4Di组表现出低频EEG活动减少，两组间功率密度差异显著（双因素重复测量方差分析；F(1, 22) = 4.812，p = 0.04；n = 12）。δ频段功率在两组间差异亦显著（非配对t检验；95% CI，0.89至9.18；对照组43.79 ± 1.78 vs. hM4Di组48.83 ± 0.92；t = 2.52，p = 0.02；n = 12）。该结果表明化学遗传学抑制VTA GABA能神经元减轻了右美托咪定诱导的镇静深度。

四、讨论与结论

本研究结合EEG、在体钙成像和GABA神经递质成像以及化学遗传学技术，揭示了右美托咪定通过增强VTA GABA能神经元的GABA能输入来抑制其活动，从而参与可唤醒性镇静的神经机制。这一发现与麻醉药物增强中枢抑制性信号、减少兴奋性信号的经典观点一致。既往研究已鉴定出从视前区（POA）GABA能神经元到VTA GABA能神经元的直接投射，且激活POA GABA能神经元可抑制VTA GABA能神经元。研究人员既往发表的研究也证明右美托咪定激活从POA投射至VTA的GABA能神经元（GABA^POA-VTA神经元）。因此，右美托咪定可能通过激活GABA^POA-VTA神经元，增加VTA中的GABA释放，进而抑制VTA GABA能神经元。

关于右美托咪定抑制VTA GABA能神经元与其镇静效应看似矛盾的问题，讨论指出这可能表明右美托咪定同时调动了镇静系统和促觉醒系统，两个系统之间的相互作用有助于维持较低的唤醒阈值，从而促成可唤醒性镇静。与丙泊酚等通常不产生可唤醒性镇静的程序性麻醉药不同，丙泊酚增强GABA_A受体并抑制VTA多巴胺能神经元活动，而右美托咪定对VTA神经环路的不同作用可能解释了其独特的可唤醒性镇静特性。

研究结论为：这些发现提示右美托咪定增强了VTA GABA能神经元的GABA能输入并抑制其活动，这可能有助于其可唤醒性镇静效应。仍需进一步研究以确立该机制的因果关系并阐明所涉及的神经环路。