《Clinical and Translational Medicine》：Graph attention network-driven single-cell omics analysis reveals how B4GALNT1-mediated glycosylation remodelling of the ferroptosis–pyroptosis network promotes drug resistance in hepatocellular carcinoma
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背景：肝细胞癌（HCC）对索拉非尼的获得性耐药伴随着氧化应激处理与程序性细胞死亡通路的协调性改变，然而膜组织如何连接这些适应性变化尚未完全阐明。为此，研究人员探究了B4GALNT1（一种神经节苷脂生物合成糖基转移酶）是否将神经节苷脂组成及脂筏结构的改变与索拉非
背景：肝细胞癌（HCC）对索拉非尼的获得性耐药伴随着氧化应激处理与程序性细胞死亡通路的协调性改变，然而膜组织如何连接这些适应性变化尚未完全阐明。为此，研究人员探究了B4GALNT1（一种神经节苷脂生物合成糖基转移酶）是否将神经节苷脂组成及脂筏结构的改变与索拉非尼耐药HCC中的铁死亡调控及caspase-1/GSDMD相关信号传导偶联起来。
方法：研究人员将TCGA-LIHC分析、单细胞转录组学、通路水平分析及图注意力网络（GAT）建模与一个含92例接受索拉非尼治疗的HCC患者、具有治疗注释的本地队列相结合。在Huh7/Huh7-SR细胞及其他肝肿瘤模型中开展功能实验，采用B4GALNT1功能获得与缺失、独立的第二sgRNA敲除克隆、GM1挽救以及野生型B4GALNT1或催化失活D358A突变体的重新表达。验证实验包括神经节苷脂谱分析、去污剂抗性膜分离、脂筏破坏/补充、铁死亡导向药理学、细胞死亡检测及异种移植研究。
结果：B4GALNT1在肿瘤相关肝细胞群体中富集，并在Huh7-SR细胞中上调。在本地队列中，较高的B4GALNT1蛋白丰度与较差的索拉非尼应答及较差的生存结局相关。B4GALNT1表达增加使神经节苷脂丰度向GM2/GM1/GD2偏移，并增加富含GM1的脂筏相关组分，而敲除则产生相反变化。B4GALNT1高表达细胞表现出GPX4和SLC7A11升高、脂质过氧化及不稳定Fe2+降低，以及铁死亡损伤减轻。与此同时，caspase-1/GSDMD相关信号传导及IL-1β/IL-18释放增加，但未出现广泛的终末膜裂解。外源性GM1部分挽救敲除相关的改变，且野生型B4GALNT1比D358A突变体更有效地恢复表型。在其他细胞模型及异种移植中观察到一致的定向效应。
结论：数据与以下模型一致：B4GALNT1重塑神经节苷脂组成及富含GM1的膜微结构域，从而支持一种药物适应状态，该状态将更强的铁死亡抵抗与受限的caspase-1/GSDMD相关膜透化相结合。这一整合表型伴随索拉非尼应答性降低，为HCC获得性耐药提供了机制基础。
研究亮点：
•B4GALNT1与经治HCC中的索拉非尼耐药及较差预后相关。
•B4GALNT1重塑神经节苷脂和脂筏，限制铁死亡损伤。
•caspase-1/GSDMD信号增加但无广泛终末膜裂解。
•遗传挽救及跨模型研究支持B4GALNT1的特异性。
论文解读
一、研究背景与科学问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌症死亡的重要来源，GLOBOCAN 2022数据显示肝癌的发病率和死亡率均存在显著的地域差异。对于晚期或不可切除的HCC，系统性治疗是疾病控制的核心手段。索拉非尼（sorafenib）作为一种多激酶抑制剂，长期用于晚期HCC的治疗，并在随机对照研究中显示出总生存获益。然而，其临床活性受到应答率有限和长期暴露过程中获得性耐药频繁出现的限制。耐药性的产生缩短了治疗获益的持续时间，并促进疾病后续进展。
从机制上看，索拉非尼耐药是多因素共同作用的结果，涉及药物处理改变、代偿性信号传导、微环境适应以及程序性细胞死亡通路的重编程。药物暴露的肿瘤细胞可通过重置调控细胞死亡的阈值而存活。铁死亡（ferroptosis）以铁依赖性脂质过氧化物积累为特征，已成为HCC索拉非尼耐药框架中的重要组成部分；焦亡（pyroptosis）则是一种炎症性膜透化程序，炎症性caspase切割gasdermin（如GSDMD）产生成孔片段。在癌症中，焦亡信号传导的后果随情境和信号强度而变化，存在完全溶解与亚致死状态之间的连续谱。这些观察提示，耐药可能涉及铁死亡防御、炎症性caspase活性及膜透化程度的协调调整，而非单一死亡通路的孤立变化。
癌症相关的糖基化改变可影响受体运输、细胞表面相互作用、代谢和信号组织，从而促进肿瘤进展和治疗适应。膜糖鞘脂增加了另一层调控维度，因为其组成影响质膜的物理和信号特性。富含胆固醇和鞘脂的脂筏（lipid raft）作为动态膜结构域，可富集特定受体和信号蛋白，改变通路效率或伙伴可用性。神经节苷脂（ganglioside）是突出的脂筏相关糖鞘脂，其中GM1尤其可调节这些结构域内的受体组织。基于此，神经节苷脂合成的改变可能通过重塑控制应激和细胞死亡信号的膜微结构域来影响药物适应。然而，膜组织如何连接氧化应激处理与程序性细胞死亡通路的适应性变化尚未完全阐明，这正是本研究的核心科学问题。
二、研究内容与核心发现
该研究旨在探究B4GALNT1（一种神经节苷脂生物合成糖基转移酶）是否将神经节苷脂组成及脂筏结构的改变与索拉非尼耐药HCC中的铁死亡调控及caspase-1/GSDMD相关信号传导偶联起来。研究人员整合了TCGA-LIHC分析、单细胞转录组学、通路水平分析及图注意力网络（graph attention network，GAT）建模，并结合一个含92例接受索拉非尼治疗的HCC患者、具有治疗注释的本地队列。在Huh7/Huh7-SR细胞及其他肝肿瘤模型中开展功能实验，采用B4GALNT1功能获得与缺失、独立的第二sgRNA敲除克隆、GM1挽救以及野生型或催化失活D358A突变体的重新表达，并通过神经节苷脂谱分析、去污剂抗性膜分离、脂筏扰动、铁死亡导向药理学、细胞死亡检测及异种移植研究进行验证。
研究得出以下核心结论：B4GALNT1在肿瘤相关肝细胞群体中富集，并在索拉非尼耐药细胞中上调；较高的B4GALNT1蛋白丰度与较差的索拉非尼应答及较差的生存结局相关。B4GALNT1表达增加使神经节苷脂丰度向GM2/GM1/GD2偏移，并增加富含GM1的脂筏相关组分，而敲除则产生相反变化。B4GALNT1高表达细胞表现出GPX4和SLC7A11升高、脂质过氧化及不稳定Fe2+降低，铁死亡损伤减轻；同时caspase-1/GSDMD相关信号传导及IL-1β/IL-18释放增加，但未出现广泛的终末膜裂解。外源性GM1可部分挽救敲除相关的改变，且野生型B4GALNT1比D358A突变体更有效地恢复表型。这一整合表型伴随索拉非尼应答性降低，为HCC获得性耐药提供了机制基础，具有重要的转化意义——B4GALNT1及其介导的神经节苷脂-脂筏重塑可能成为克服索拉非尼耐药的潜在治疗靶点。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下几类关键技术方法：其一，公共数据挖掘与生物信息学分析，包括TCGA-LIHC转录组数据的差异表达分析、基因集富集分析（GSEA）、生存分析及ROC分析，以及GEO数据集GSE202642（含3例癌旁正常样本和3例肿瘤样本）的单细胞RNA测序数据分析，通过UMAP聚类、细胞类型注释和肝细胞亚群再聚类解析B4GALNT1的细胞分布特征；其二，图注意力网络（GAT）模型构建，以支持向量机（SVM）和随机森林（RF）作为方法学比较器，通过特征重要性排序和Circos网络可视化整合糖基化-铁死亡-焦亡模块；其三，体外功能实验体系，包括Huh7/Huh7-SR细胞系的建立（通过间歇性、阶梯式剂量递增策略在约6个月内建立稳定耐药株）、B4GALNT1过表达和CRISPR/Cas9敲除稳定细胞株的构建、神经节苷脂谱分析（薄层色谱和靶向LC-MS/MS）、去污剂抗性膜（DRM）分离及蔗糖密度梯度超速离心、脂筏扰动实验（MβCD和胆固醇补充）、铁死亡药理学干预（erastin和ferrostatin-1）、细胞死亡检测（Annexin V/PI流式、LDH释放、PI染色）、氧化应激指标检测（C11-BODIPY、FerroOrange、MDA、GSH/GSSG、DCF-DA、MitoSOX）及线粒体功能评估（JC-1、ATP、透射电镜）；其四，体内验证，包括BALB/c裸鼠皮下异种移植模型及索拉非尼治疗；其五，本地临床队列分析，纳入92例接受索拉非尼治疗的HCC患者，通过免疫组化H-score评分评估B4GALNT1蛋白表达与治疗应答及生存的关联。
四、研究结果
3.1 B4GALNT1在HCC中的表达及其与临床特征和结局的关联：TCGA-LIHC分析显示，B4GALNT1转录水平在HCC中高于癌旁或非肿瘤肝组织，且随病理T分期和总体分期升高而上升。B4GALNT1高表达组患者的总生存期较短，ROC分析显示B4GALNT1区分肿瘤与非肿瘤样本的AUC约为0.915。
3.2 单细胞转录组揭示B4GALNT1在肝细胞群体中的富集及其与铁死亡/焦亡相关表型的关联：单细胞RNA测序分析显示，B4GALNT1表达主要定位于肝细胞相关区域。肿瘤来源肝细胞的抗铁死亡评分和焦亡易感性评分均高于癌旁组织来源的肝细胞。在肝细胞内，B4GALNT1表达与GPX4、GSDMD和IL1B呈正相关（r = 0.29、0.34和0.41，均p < 0.001）。
3.3 本地临床队列分析支持B4GALNT1表达与HCC索拉非尼应答的关联：在92例接受索拉非尼治疗的HCC患者中，B4GALNT1 H-score在疗效差/疾病进展组中更高。B4GALNT1高表达组中60.9%为疗效差/进展，而低表达组仅为28.3%。高表达组的无进展生存期和总生存期均较短，多因素Cox回归分析显示高B4GALNT1表达与总生存独立相关（HR = 1.97，95% CI 1.07–3.61，p = 0.028）。
3.4 通路富集和GAT优先排序将B4GALNT1与糖鞘脂和程序性细胞死亡程序联系起来：B4GALNT1高表达肿瘤富集O-聚糖生物合成、神经节系列糖鞘脂生物合成、鞘脂代谢及谷胱甘肽代谢相关基因集。GAT模型的ROC性能优于SVM和RF，B4GALNT1在特征重要性排序中位列第一，其他高排名基因包括GPX4、SLC7A11、GSDMD、NLRP3、TFRC、SLC3A2、ALOX15、NFE2L2、IL1B、PYCARD、CASP4和ST6GAL1。Circos网络可视化显示B4GALNT1连接糖基化相关基因（ST6GAL1、GCNT2、MGAT5）及铁死亡和炎症性细胞死亡信号调控因子。
3.5 B4GALNT1在获得性耐药Huh7-SR细胞系中显著上调：与亲本Huh7细胞相比，Huh7-SR细胞的B4GALNT1蛋白和转录水平均升高，同时表现出更高的JC-1红/绿比值、ATP含量、更低的LDH释放和更大的耐药指数。
3.6 B4GALNT1上调驱动耐药，而敲除恢复索拉非尼敏感性：过表达B4GALNT1使剂量-反应曲线向低敏感性方向偏移，而敲除增加敏感性。集落形成和EdU掺入在过表达细胞中更高、在敲除细胞中更低。Annexin V/PI分析显示敲除后药物相关死亡比例最大，过表达后最小。相对IC50值遵循相同顺序。
3.7 B4GALNT1抑制铁死亡损伤同时促进受限的caspase-1/GSDMD信号传导：过表达B4GALNT1降低C11-BODIPY氧化、不稳定Fe2+、MDA和总ROS，提高GSH/GSSG比值，GPX4和SLC7A11蛋白增加。同时，cleaved caspase-1和GSDMD-N增加，IL-1β和IL-18分泌增多，膜相关GSDMD-N增加，但膜通透性动力学保持受限，未显示广泛终末裂解。
3.8 B4GALNT1驱动神经节苷脂代谢重编程并促进富含GM1/GM2的脂筏重塑：过表达B4GALNT1增加GM2、GM1和GD2丰度，并增加去污剂抗性膜中的GM1富集；敲除则相反。MβCD急性暴露降低DRM相关GM1富集，胆固醇补充部分恢复表型。
3.9 B4GALNT1扰动与细胞表面聚糖读出的继发性改变相关：过表达B4GALNT1增强VVA、SBA和RCA-I凝集素结合，O-糖蛋白组学显示Tn/T抗原相关结构和总O-聚糖信号增加。这些变化被解释为神经节苷脂/膜组织改变的继发性后果。
3.10 GM1补充部分逆转铁死亡相关改变并恢复caspase-1/GSDMD相关信号传导：外源性GM1降低敲除相关的脂质ROS升高，部分恢复GPX4和SLC7A11，恢复cleaved CASP1/CASP1和GSDMD-N水平及IL-1β/IL-18分泌，CASP1-GM1共定位部分恢复。
3.11 GM1补充部分恢复B4GALNT1缺陷细胞的索拉非尼耐受性：GM1补充后，敲除细胞的活力、IC50、集落生长和GSH水平均部分恢复。
3.12 跨模型、遗传特异性和药理学验证：在HepG2和MHCC97H细胞及其耐药衍生物中复现了主要定向改变。独立的第二sgRNA敲除克隆（KO-2）在Huh7和Huh7-SR细胞中均降低B4GALNT1、GPX4和SLC7A11，减少cleaved CASP1、GSDMD-N和IL-1β/IL-18分泌，增加MDA、ROS和PI阳性细胞。遗传挽救实验显示野生型B4GALNT1比D358A催化失活突变体更有效地恢复表型。
五、结论
该研究的数据与以下模型一致：B4GALNT1重塑神经节苷脂组成及富含GM1的膜微结构域，从而支持一种药物适应状态，该状态将更强的铁死亡抵抗与受限的caspase-1/GSDMD相关膜透化相结合。这一整合表型伴随索拉非尼应答性降低，为HCC获得性耐药提供了机制基础。研究通过多层次的证据链——从公共数据库挖掘、单细胞转录组分析、GAT网络建模、体外功能实验到体内异种移植验证和临床队列分析——系统性地确立了B4GALNT1作为连接糖基化修饰、膜组织与程序性细胞死亡调控的关键节点。该发现不仅深化了对HCC索拉非尼耐药机制的理解，还为开发针对B4GALNT1或神经节苷脂-脂筏轴的联合治疗策略提供了理论依据，具有潜在的转化医学价值。
