基于多组学整合与机器学习构建与颈动脉斑块易损性及进展相关的ACKR1+内皮细胞乳酸-免疫特征

《Clinical and Translational Medicine》：Multi-omics integration and machine learning identify an ACKR1+ endothelial cell-based lactate-immune signature associated with carotid plaque vulnerability and progression

摘要 背景：早期识别易损颈动脉斑块对于卒中预防至关重要，但与内皮细胞转变及免疫募集相关的上游代谢过程仍鲜有阐明。研究人员在人类颈动脉斑块中表征了ACKR1+内皮细胞（ECs）的乳酸代谢，并构建了一个用于判别斑块易损性的机器学习特征。 方法：整合内部及外部（GSE253903）单细胞数据集以鉴定内皮细胞亚群，并利用批量转录组数据（GSE163154）及内部蛋白质组学数据评估代谢-免疫相关性。采用最小绝对收缩与选择算子（LASSO）回归筛选核心特征以构建逻辑回归模型，该模型被锁定并应用于三个独立队列：GSE43292（Stary分期≥IV vs. I–II）、GSE28829（早期 vs. 晚期病变）及GSE100927（正常 vs. 动脉粥样硬化动脉）。关键分子通过免疫组织化学（IHC）及空间转录组学在独立斑块（5例稳定、5例不稳定）中原位验证。 结果：一个与新生血管形成相关的ACKR1+ EC亚群表现出糖酵解过度活跃及乳酸代谢增强。计算推断将乳酸蓄积与HIF-1α稳定性、CXCL12释放及经CXCL12–CXCR4轴的CD8+ T细胞浸润相关联，且单羧酸转运体SLC16A3与SLC16A4成为该“乳酸-免疫”状态的定量读出指标。在不稳定斑块中，IHC证实非典型趋化因子受体1（ACKR1；几何平均比[GMR] = 6.82）、CD8+ T细胞密度（GMR = 4.63）、SLC16A3（GMR = 4.74）及HIF-1α（GMR = 4.02；所有q < .05）均升高，且脂质核心中乳酰化水平升高。一个四特征模型（ACKR1、SLC16A3、SLC16A4、CD8+ T细胞细胞毒性评分）在训练集中表现良好，并在进展分层队列中保持判别能力，而在GSE100927中，该模型在三个动脉床中均表现出较高的疾病识别性能。 结论：低氧条件下的乳酸代谢重编程与ACKR1+ EC相关的CD8+ T细胞募集及斑块不稳定性相关。该链条是一个基于关联的假说，需功能学验证。该特征在易损性分层及疾病识别两个层面均表现出稳健的判别能力，为动脉粥样硬化斑块的分子分型提供了可量化的框架。

多组学整合与机器学习解析ACKR1⁺内皮细胞乳酸-免疫特征：颈动脉斑块易损性与进展的分子分型新框架

一、研究背景与科学问题

颈动脉粥样硬化斑块的破裂是缺血性卒中及致命性心血管事件的首要原因。在临床实践中，早期识别具有高破裂风险的“易损斑块”对预防急性脑血管事件至关重要。尽管当前影像学技术在评估斑块形态方面取得了长足进步，但无创捕捉斑块内部深层分子生物学过程仍面临挑战。近年来，人工智能与医学的深度融合使基于多组学数据的机器学习（ML）模型成为突破该瓶颈的前沿手段，其能够将高维分子转录组数据转化为可量化的分子判别评分。然而，现有预测模型主要依赖广泛的炎症或脂质代谢基因池，缺乏对特定致病微环境及细胞间通讯的精准聚焦，一定程度上限制了其生物学可解释性与临床转化潜力。

靶向免疫微环境已被认为是稳定易损斑块的潜在治疗策略。在寻找更具特异性的预测靶点过程中，斑块微环境内的“免疫代谢”重编程引起了研究人员的关注。免疫代谢重编程指斑块内免疫及基质细胞在局部低氧、脂质蓄积及慢性炎症影响下发生的能量代谢通路适应性改变，如从氧化磷酸化（OXPHOS）向有氧糖酵解的转变；这种代谢状态反过来调控其免疫表型与效应功能。更重要的是，代谢物本身可作为信号分子。乳酸不仅是糖酵解的终产物，还可通过组蛋白及非组蛋白乳酰化这一表观遗传修饰直接调控基因表达，从而紧密耦合细胞的“代谢状态”与“免疫功能”。这一连接代谢与免疫的概念为在斑块微环境中识别更具特异性的预测靶点提供了新视角。

单细胞分析在解析动脉粥样硬化组织异质性及推动精准医学方面发挥着日益重要的作用。单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究已证实T细胞，尤其是CD8⁺ T细胞，在人类动脉粥样硬化斑块中占主导地位，其广泛浸润与斑块不稳定性密切相关。一项发表于《Circulation》的突破性研究利用三维人类动脉粥样硬化斑块培养模型阐明：高表达非典型趋化因子受体1（ACKR1）的斑块内血管内皮细胞（ECs）可通过分泌C-X-C基序趋化因子配体12（CXCL12）有效募集CD8⁺ T细胞。然而，该研究未进一步阐明这一特定细胞类型介导的募集过程与斑块不稳定性之间的关联。与此同时，由低氧斑块微环境诱导的高糖酵解活性及乳酸蓄积正被重新定义——从单纯的代谢废物转变为核心表观遗传调控因子。2025年发表的权威心血管研究强调，乳酸介导的“乳酰化”在心血管疾病的炎症与血管生成中发挥关键的“双刃剑”作用。值得注意的是，乳酸诱导的缺氧诱导因子1α（HIF-1α）乳酰化可通过阻断其被von Hippel–Lindau（VHL）泛素化复合物识别而显著增强HIF-1α蛋白稳定性。基于上述进展，研究人员提出一个潜在的斑块易损性致病轴：低氧微环境中蓄积的乳酸可能通过稳定HIF-1α驱动ACKR1⁺ ECs的促炎转变，从而触发CD8⁺ T细胞的致病性浸润。

尽管近期生物信息学研究已开始关注动脉粥样硬化中乳酰化相关基因的宏观转录组异常，但迄今为止尚无研究将“乳酸代谢”与特定单细胞亚群（ACKR1⁺ ECs）的免疫募集功能相整合，且缺乏基于这一复杂机制网络开发的ML预测工具。为弥合生物学机制与分子分型之间的鸿沟，本研究采用“计算驱动的机制推断与模型开发”策略，旨在提供一个兼具判别性能与生物学可解释性的斑块易损性分子分型工具。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员整合了内部及外部多组学数据。内部数据包括来自北京协和医院颈动脉内膜剥脱术（CEA）患者的10例颈动脉斑块scRNA-seq样本（7例稳定、3例不稳定）及82例颈动脉斑块蛋白质组学数据（37例稳定、45例不稳定），后者来源于COAS-CAS前瞻性研究队列（ClinicalTrials.gov: NCT05629000）。外部数据包括单细胞验证数据集GSE253903、训练队列GSE163154（43例斑块内出血[IPH]与非IPH样本）以及三个独立验证队列GSE43292、GSE28829和GSE100927。主要技术方法包括：单细胞转录组数据处理与无监督聚类、细胞通讯分析（CellChat）、转录因子活性推断（DoRothEA/VIPER）、代谢特征模块评分、LASSO惩罚逻辑回归特征选择与模型构建、嵌套留一法交叉验证（LOOCV）、免疫组织化学（IHC）及空间转录组学原位验证。

三、主要研究结果

3.1 ACKR1在斑块内呈现内皮特异性表达，且ACKR1⁺ ECs与斑块内新生血管形成高度相关

通过内部scRNA-seq数据的UMAP降维分析，鉴定出18个细胞亚群。在内皮细胞群中识别出两个转录组学上截然不同的亚群：Cluster 11（ACKR1⁺ ECs）和Cluster 7（ACKR1^? ECs）。ACKR1在斑块内其他所有细胞类型中几乎不表达，表明其表达具有高度内皮特异性。差异表达分析显示，ACKR1⁺ ECs显著富集血管生成相关基因（如APLNR）及CXCL12，基因本体论（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析证实该亚群与血管生成、脉管发育调控及apelin信号通路密切相关，支持其与斑块内新生血管形成的紧密关联。

3.2 ACKR1⁺ ECs在炎症通路下调的同时呈现糖酵解与乳酸代谢过度活跃，并与CD8⁺ T细胞局部富集相关

基因集富集分析（GSEA）显示ACKR1⁺ ECs中“TNFA SIGNALLING VIA NFKB”炎症通路显著下调，而糖酵解相关转录因子GLI2活性显著升高，OXPHOS通路活性显著降低。核心糖酵解酶表达水平在ACKR1⁺ ECs中普遍升高。基于12基因乳酰化特征及GO乳酸代谢通路的模块评分均显示ACKR1⁺ ECs显著高于ACKR1^? ECs。在T细胞亚群中，Cluster 4被鉴定为高表达CXCR4的CD8⁺ T细胞。在不稳定斑块组中，该亚群比例呈上升趋势但未达统计学显著性；患者水平比较显示不稳定组HIF1A、CXCL12及核心糖酵解酶表达水平更高。

3.3 外部scRNA-seq数据集GSE253903独立验证研究结果

在外部数据集中同样鉴定出两个内皮亚群（Cluster 7为ACKR1⁺ ECs，Cluster 10为ACKR1^? ECs）。差异表达及通路富集分析结果与内部数据高度一致：ACKR1⁺ ECs中APLNR与CXCL12显著升高，血管生成及apelin信号通路激活，而TNF及NF-κB炎症信号通路显著下调。关键基因比较显示血管生成、糖酵解及乳酸代谢相关分子均呈升高趋势。值得注意的是，HIF-1α脯氨酰羟化酶EGLN1（PHD2）在ACKR1⁺ ECs中显著降低，提示该亚群中HIF-1α降解通路可能被削弱。

3.4 外部转录组队列GSE163154提示IPH斑块中ACKR1、HIF1A、糖酵解、乳酸代谢及CD8⁺ T细胞浸润相关分子上调，炎症、糖酵解及低氧通路显著激活

差异表达分析显示IPH组中ACKR1、HIF1A、乳酸代谢相关基因（LDHB、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A7）、核心糖酵解酶（ALDOA、ALDOC、GAPDH、HK2、PFKL、PFKM、PKM）及CD8⁺ T细胞浸润标志物（CD8A、GZMA、GZMB、IFNG、PRF1、CXCR4）均显著上调。通路富集分析揭示了斑块内显著的炎症微环境，HALLMARK分析证实“TNFA SIGNALLING VIA NFKB”通路激活，GSEA显示“GLYCOLYSIS”与“HYPOXIA”通路均显著上调。

3.5 外部转录组队列GSE163154及内部蛋白质组学提示ACKR1和HIF1A与糖酵解、乳酸代谢及CD8⁺ T细胞浸润显著相关

相关性分析显示ACKR1与HIF1A（r = .47）、HIF1A与CXCL12（r = .42）显著正相关；ACKR1与核心糖酵解酶（HK2、PKM、PFKL、ALDOA、GAPDH）及CD8⁺ T细胞浸润核心分子显著正相关，与乳酸转运体SLC16A3正相关、与SLC16A4及SLC16A7负相关。HIF1A同样与糖酵解、乳酸代谢及CD8⁺ T细胞细胞毒性评分（CD8_Tox_Score）显著相关。细胞组成调整分析显示，ACKR1与部分糖酵解及乳酸转运分子的相关性在调整后减弱，而HIF-1α–CXCL12关系保持稳定，提示后者反映细胞内调控耦联。内部蛋白质组学证实不稳定斑块中ALDOB显著上调。

3.6 机器学习特征选择与模型构建

以GSE163154为训练队列，基于多组学交叉验证得到的核心代谢-免疫变量集，采用LASSO惩罚逻辑回归进行高维特征降维，经10折交叉验证确定最优惩罚参数，最终锁定四个核心特征：ACKR1、SLC16A3、SLC16A4及CD8_Tox_Score。基于此构建多变量逻辑回归判别模型，并通过完全嵌套LOOCV及1000次bootstrap重采样进行内部性能评估与乐观偏差校正。

3.7 独立外部验证与列线图构建

将锁定模型直接应用于三个独立外部验证队列。在GSE43292（Stary分期≥IV vs. I–II）及GSE28829（早期 vs. 晚期病变）中，模型在进展分层层面保持判别能力；在GSE100927（正常 vs. 动脉粥样硬化动脉）中，模型在颈动脉、股动脉及膝下动脉三个动脉床均表现出较高的疾病识别性能。通过受试者工作特征（ROC）曲线、校准曲线、Brier评分及决策曲线分析（DCA）评估了模型的判别性能、校准度及临床效用，并构建列线图展示模型内部结构。

3.8 免疫组织化学及空间转录组学原位验证

在独立斑块样本（5例稳定、5例不稳定）中，IHC定量分析证实不稳定斑块中ACKR1（几何平均比[GMR] = 6.82）、CD8⁺ T细胞密度（GMR = 4.63）、SLC16A3（GMR = 4.74）及HIF-1α（GMR = 4.02）均显著升高（所有q < .05），且脂质核心中乳酰化水平（Pan-Kla）显著升高。空间转录组学分析进一步在组织原位水平验证了ACKR1⁺ ECs与CD8⁺ T细胞的空间邻近关系。

四、结论与讨论

本研究通过多组学整合与机器学习策略，系统揭示了以ACKR1⁺ ECs为核心的“乳酸-免疫”串扰网络与颈动脉斑块易损性的关联。研究证实ACKR1⁺ ECs亚群呈现糖酵解过度活跃及乳酸代谢增强的特征，乳酸蓄积与HIF-1α稳定性、CXCL12释放及经CXCL12–CXCR4轴的CD8⁺ T细胞募集相关联。基于此机制网络构建的四特征模型在斑块易损性分层及疾病识别两个层面均表现出稳健的判别能力，为动脉粥样硬化斑块的分子分型提供了可量化的框架。研究人员明确指出，该代谢-免疫链条是基于关联的假说，仍需功能学实验加以确证。该研究将生物学机制解析与机器学习预测模型开发相结合，为心血管疾病的精准医学提供了兼具可解释性与判别性能的新工具。