HMA-Venetoclax方案治疗急性髓系白血病应答的免疫与细胞决定因素：单细胞RNA测序和TCR谱分析揭示细胞毒性CD8+ T细胞与LAG-3的作用

《HemaSphere》：Immune and cellular determinants of response to HMA-venetoclax regimens in acute myeloid leukemia

去甲基化药物（hypomethylating agents, HMAs）联合Venetoclax已重塑急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）的治疗格局，但其应答的生物学决定因素仍不明确。研究人员在132例接受HMA-Venetoclax治疗的新诊断或复发/难治性AML患者中整合了临床与基因组分析，并在10例新诊断病例中进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和T细胞受体（T cell receptor, TCR）谱分析，以界定应答的细胞与免疫相关性。应答率和生存与已发表数据一致。DNA测序（DNA sequencing）证实了IDH2的有益影响以及TP53突变的预后不良。scRNA-seq和TCR分析显示，应答者表现出细胞毒性CD8⁺ T细胞扩增、TCR克隆多样性增加以及抗原呈递通路激活。非应答者显示基线炎症信号、髓系成熟受损以及富集IDO1⁺树突状细胞（dendritic cells, DCs）的抑制性微环境。耐药AML显示干细胞样去分化和持续性上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）。LAG-3表达标记功能障碍T细胞状态，并成为潜在生物标志物和治疗靶点。

研究背景：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是起源于髓系定向新生物克隆成熟阻滞和增殖优势的基因组异质性恶性肿瘤。强化化疗以及较新的低强度方案，如去甲基化药物（hypomethylating agents, HMAs）联合BCL2抑制剂Venetoclax，已改善应答率，包括老年或不适合强化疗患者，但长期缓解仍不常见且耐药频繁。耐药机制涉及MCL1等替代抗凋亡蛋白上调、BAX突变以及TP53、NRAS、FLT3突变，但免疫失调对Venetoclax耐药的贡献仍不明确。为此，研究人员在HMA-Venetoclax治疗AML队列中开展bulk基因组和单细胞转录组联合分析，聚焦早期治疗时间点，解析应答的分子和免疫决定因素。该论文发表在《HemaSphere》。

关键方法：回顾性分析132例接受HMA联合Venetoclax治疗的AML患者；单细胞队列来自Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico的10例新诊断de novo AML患者，于诊断（TP1）和第一周期后（TP2）采集骨髓。主要技术包括靶向73基因的二代测序（next-generation sequencing, NGS）；10x Genomics 5′单细胞RNA和TCR测序；Cell Ranger、SoupX、DoubletFinder、Seurat、Harmony预处理与整合；基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）；GSVA计算EMT评分；scRepertoire分析TCR克隆；Numbat推断拷贝数变异（copy number variation, CNV）。

研究结果：

HMA-Venetoclax治疗AML的临床结局：132例AML患者中，99例有NGS数据。最常见突变为TET2、DNMT3A、NPM1、ASXL1，TP53、FLT3、IDH2、NRAS各占17%。65例一线治疗，67例后线治疗；中位随访17.06个月，一线与后线总生存（overall survival, OS）无显著差异。一线复合完全缓解率（CR+CRi）为82.3%，后线为57.6%，后线仍与VIALE-A报道一致。ELN2024风险分层保留预后意义，在初治患者中更好。IDH2突变者未达中位OS，TP53突变者中位OS仅4.35个月。NPM1或IDH1突变在本队列未见OS获益。接受异基因造血干细胞移植者OS获益最大。

单细胞图谱揭示HMA-Venetoclax治疗后AML细胞频率的应答相关变化：对10例新诊断AML的127,135个高质量骨髓细胞进行scRNA-seq，TP1为58,643个，TP2为68,492个。TP2时8/10达完全缓解或完全缓解伴计数未完全恢复。治疗失败者富集TP53和NRAS突变。92%细胞可注释。基线时，应答者富集粒细胞-单核细胞祖细胞（granulocyte-monocyte progenitors, GMPs）和多能祖细胞（multipotent progenitors, MPPs），非应答者T细胞比例较高。TP2时，应答者CD4⁺、CD8⁺ T细胞及早期红系/巨核祖细胞扩增；非应答者诊断时即有持续T细胞浸润。7/10有异常核型，Numbat将CNV主要追踪至髓系来源细胞。病例分为未成熟、中间和成熟单核细胞样表型。难治病例出现谱系转换或未成熟状态持续；一例RAS突变单核细胞样AML在TP2转向未成熟表型，RNA velocity支持该转变，并与共享8三体和17缺失克隆相关。

HMA-Venetoclax治疗AML患者治疗应答与难治性疾病的转录组特征：GSEA显示，基线非应答者IFN、TNFα/NF-κB和EMT通路显著上调；TP2时难治者仍富集这些通路，而应答者在治疗后出现IFN和抗原呈递通路激活。应答者IFN-γ富集由MHC I类分子HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G，趋化因子CCL5及STAT4等驱动；非应答者呈IDO1、METTL7B、VCAM1等耐受性和促白血病特征。IDO1主要定位于常规1型树突状细胞（conventional type 1 dendritic cells, cDC1）。非应答者TNFα/NF-κB leading-edge基因包括MCL1、FOS、FOSB、RHOB，尤其在未成熟和单核细胞样髓系细胞中；应答者则为治疗后炎症激活。非应答者TP1多种细胞STAT1升高。EMT相关PRSS2、LGALS1、BASP1在TP53突变病例持续，RAS信号在两例未持续缓解者中持续激活。

转录组分析揭示AML原始细胞中与Venetoclax耐药相关的炎症重编程和干细胞样程序：在髓系不同成熟状态中，非应答者均富集炎症程序。NOTCH信号在未成熟髓系细胞中选择性活跃，TP53突变AML中HES1、NOTCH1、JAG1和DLK1上调。EMT程序在未成熟和中间髓系亚群激活，TP53突变者治疗后增强并伴TGFB上调。TCGA AML队列中，EMT高评分者OS更短，PRSS2过表达标记高风险亚组；多因素分析中TP53突变仍是最强不良预后因素。MCL1在全骨髓治疗后中位表达在应答组间相近，但ER和RR患者在TP2的未成熟原始细胞和单核细胞中MCL1升高；BCL2A1在ER/RR尤其TP53突变者治疗后上调，应答者呈BCL2L1升高趋势；BAK和BH3-only蛋白未追踪治疗应答。

CD4⁺ T细胞表型与克隆重塑可分层Venetoclax为基础治疗的应答：分析41,755个单T细胞及配对TCR，其中CD4⁺ T细胞24,721个。基线时ER/RR患者CD4⁺ T细胞比例高于应答者，TP2时逆转，应答者CD4⁺细胞扩增。应答者小频率克隆型增加，提示TCR多样化和免疫激活；ER/RR克隆重塑少。CD4⁺分为5种状态：C1富集于ER/RR，表达FOS、NFKB1、USP51、BACH2；C2主要见于应答者，表达GZMA、GZMK、ZNF683；C3为na?ve T细胞；C4为调节性T细胞；C5仅见于ER/RR TP2，表达IL22。纵向追踪158个持续CD4 TCR，主要见于应答者，持续克隆上调GZMA、GZMH、NKG7；丢失克隆表达FOSB、CD39、SLC27A2；新出现克隆表达CD80、MMP9、OSM、SOCS3。应答者中3/6出现CD4 T细胞扩增或持续，ER/RR中为0/4。

CD8⁺ T细胞扩增与细胞毒性重塑与良好结局相关：基线ER/RR患者CD8⁺ T细胞较高，治疗后下降；应答者从9.6%升至18.2%。仅应答者在终末效应记忆RA（terminal effector memory RA, TEMRA）亚群出现超扩增克隆，TCR多样性小克隆增加；ER/RR多样性静态。应答者TEMRA表达ZNF683、PCBP2，非应答者表达JUND、FOSB、DUSP2。ER/RR的效应记忆CD8⁺细胞表达LAG3、NEAT1、IFITM2，中枢记忆细胞表达KLRD1、JUN；应答者效应记忆细胞CXCR4升高。纵向追踪607个持续CD8⁺克隆，应答者扩增主要位于TEMRA，表达ZNF683、ITM2A、ITGAM；非应答者上调DUSP2、JUN、FOS。PD-1、CTLA-4、TIM-3表达有限，而LAG-3在非应答者约25% CD8⁺ T细胞中持续表达，治疗后仍高，尤其效应记忆亚群。

讨论与结论：研究人员整合DNA测序、单细胞RNA和TCR测序，描绘了HMA-Venetoclax治疗AML的克隆群体和骨髓免疫微环境。耐药与NOTCH和RAS驱动的未成熟髓系表型相关，尤其TP53或NRAS突变病例；基线非应答者IFN和NF-κB炎症信号增强，形成抑制性骨髓龛，IDO1、METTL7B、VCAM1等耐受性标志物升高。应答者在原始细胞清除后出现诱导性IFN反应、MHC I类分子和CCL5等免疫刺激基因升高。T细胞 repertoire 显示，应答者有细胞毒性CD4⁺和CD8⁺ TEMRA克隆重塑、TCR多样性增加和效应克隆持续扩增；非应答者T细胞库静态，富集炎症和功能障碍相关基因，LAG-3持续表达。PD-1、CTLA-4、TIM-3总体较低。研究局限为单细胞队列小，部分签名由个别突变病例驱动，需更大独立队列验证。

研究结论翻译：总之，研究人员的数据描绘了白血病基因型、髓系分化状态、炎症信号和T细胞功能动态之间错综复杂的相互作用，这些因素共同决定HMA-Venetoclax应答。耐药的特征是未成熟髓系表型、慢性炎症以及以免疫调节偏斜为标志的僵硬且功能障碍的T细胞应答的汇聚。相反，应答者表现出有效的T细胞参与、细胞毒性持久性和适应性T细胞库重塑，这与在治疗开始后迅速出现的疾病清除中的主动免疫作用一致。该研究的一个局限性是样本队列有限。然而，研究人员的初步观察强调了将HMA-Venetoclax与旨在恢复T细胞适应性或减轻白血病龛内免疫抑制的干预措施联合的潜力，以维持和巩固AML的临床缓解。