eDNA揭示干旱澳大利亚恢复地土壤真菌轨迹及再引入Greater Bilby（Macrotis lagotis）与环境真菌相互作用

《Austral Ecology》：Using eDNA to Investigate Soil Fungal Trajectory and Mammal-Fungi Interactions at an Arid Australian Restoration Site

　　

土壤真菌调控陆地生态系统功能与生产力。本地挖掘哺乳动物影响土壤理化性质，因此可能影响土壤真菌群落；然而，尽管其已在干旱澳大利亚许多地区重新建立，再引入区域挖掘哺乳动物对土壤真菌的影响仍很大程度上未知。研究人员使用高通量DNA测序（high-throughput DNA sequencing）表征了一个干旱哺乳动物恢复地（Wild Deserts）及邻近挖掘哺乳动物灭绝地区的土壤真菌群落，并评估了再引入的挖掘哺乳动物Greater Bilby（Macrotis lagotis）粪便中的真菌内容。研究人员评估了保护区内、外土壤样本中真菌功能类群（fungal functional guilds）的丰富度、组成、空间均匀度和丰度。此外，评估了在若干时间点（再引入前和再引入后）采集的bilby粪便样本中真菌及真菌功能类群的组成。初始再引入约3年后，有挖掘哺乳动物存在和无挖掘哺乳动物存在区域之间的土壤真菌群落在所评估任一指标上均无差异。在bilby粪便中，采样期之间检测到的真菌类群存在显著差异。凋落物腐生真菌Chlorophyllum在Wild Deserts释放三年后采集的bilby粪便中较释放前更丰富，并且若干粪便中Chlorophyllum相对高丰度可能指示bilby对该真菌的机会性取食。尽管在研究期间未观察到恢复区内外土壤真菌群落差异，但土壤样本与释放后粪便中检测到的真菌分类单元之间存在强烈重叠，这与bilby在Wild Deserts与环境真菌相互作用一致。研究人员工作强调需要改进对澳大利亚干旱区真菌的认识，并需要长期监测方案来建立真菌群落基准，并阐明挖掘哺乳动物影响土壤真菌恢复的机制和时间尺度。

论文主体解读

研究背景与问题：干旱澳大利亚土壤因年龄、长期风化和欧洲牧业退化而相对低产、养分贫瘠。放牧降低植被覆盖、压实土壤并促进侵蚀。原生挖掘哺乳动物，如bettongs（Bettongia spp.）、Greater Bilby（Macrotis lagotis）和bandicoot species（Perameles and Isodon spp.），通过掘洞和觅食进行土壤生物扰动（bioturbation），改变土壤理化性质，因而可能影响土壤真菌。土壤真菌驱动分解、养分矿化、植物养分获取，并形成菌根共生，稳定土壤和维持生态系统功能。然而，澳大利亚干旱区真菌多样性知识有限，哺乳动物–真菌相互作用了解不足；尽管许多推测具食真菌习性的挖掘哺乳动物被再引入保护地，但再引入对干旱土壤真菌群落的影响仍不清楚。物种丧失可能引发生态级联，甚至导致真菌共生体“共灭绝”，威胁真菌介导的养分循环和土壤碳储存等服务。因此，研究人员在Wild Deserts恢复地研究：恢复区与周边景观土壤真菌的多样性、分类和功能组成、空间分布是否存在差异；并通过分析bilby粪便真菌，了解其与环境真菌的生态相互作用。

研究开展、结论与意义：研究在干旱NSW的Wild Deserts项目开展。该区域通过保护围栏移除feral predators、红袋鼠及引入食草动物，并再引入局部灭绝的小型哺乳动物，包括bilbies和Shark Bay Bandicoots（Perameles isoodon或Perameles bougainville）。研究人员比较保护区内有挖掘哺乳动物区域与围栏外无挖掘哺乳动物区域的土壤真菌，并分析bilby在再引入前、释放一个月后和释放三年后的粪便真菌。约3年后，土壤真菌群落在丰富度、常见与稀有类群组成、空间均匀度及功能类群丰度上均未显示保护区内、外差异。bilby粪便中真菌功能类群在采样期之间存在显著差异；Chlorophyllum在释放三年后粪便中更丰富，可能反映机会性取食。土壤与释放后粪便真菌分类单元强烈重叠，与bilby在Wild Deserts与环境真菌相互作用一致。该工作强调应改善澳大利亚干旱区真菌知识，并建立长期监测基准，以阐明挖掘哺乳动物影响土壤真菌恢复的机制和时间尺度。

主要关键技术方法（≤250字）：研究地点为Sturt National Park内Wild Deserts项目。土壤采样在20 km² south paddock内外6个沙丘地点进行，每地点设置保护区内、外配对网格，每网格15个土样。bilby粪便样本来源包括Taronga Western Plains Zoo（TWPZ）再引入前个体、释放后约1个月，以及2023年4月在Wild Deserts south paddock通过40个cage traps采集；Wild Deserts种群于2021年由Thistle Island（SA）个体补充。采用土壤和粪便DNA提取，扩增核糖体内部转录间隔区1（ITS1），在South Australia Genomics Centre（SAGC）建库，Illumina MiSeq v3 300 bp双端测序。序列经QIIME2及DADA2去噪、去除嵌合体、合并读长并生成扩增子序列变异（amplicon sequence variants，ASVs），用UNITE数据库注释分类，FungalTraits注释功能类群；统计使用R、phyloseq、lme4、GLLVM、mvabund、Moran's I和ANCOMBC。

研究结果

3.1 土壤真菌群落特征：通过高通量测序和ASV分析，土壤真菌数据集包含4 157 539 reads，平均每样本23 097 reads，共2475个真菌ASVs，平均每样本157±41个ASVs。3.83% reads未能分类到Kingdom Fungi，3.31%属于未定真菌谱系（incertae sedis）。Ascomycota占76.78%，Basidiomycota占10.66%，Chytridiomycota占3.65%。167个ASVs仅见于保护区内，192个仅见于保护区外，2073个（83.76%）为共享ASVs。

3.2 土壤真菌丰富度和群落组成：通过稀释后alpha多样性分析及常见/稀有类群多变量模型，未发现保护区内、外土壤真菌alpha多样性显著差异，也未发现常见或稀有真菌组成存在处理相关模式。

3.3 空间分布（均匀度）：通过Moran's I空间自相关指数评估，保护区内、外真菌ASVs的Moran's I值相似，范围为?0.17至0.20，接近0，提示随机空间分布，未显示处理间空间均匀度差异。

3.4 土壤中真菌功能类群丰度：土壤真菌属属于15个功能类群。腐生真菌最丰富，占全部土壤reads的48.4%（2 011 467 reads）。保护区内、外功能类群相对丰度无显著差异。外生菌根（ectomycorrhizal，ECM）是唯一检测到的菌根类型，仅2个ASVs，出现于6个样本中，且丰度低；二者均属Dingleya，注释为gasteroid-hypogeous fruiting body（“假块菌”）。丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌未在土壤样本中检测到。

3.5 Bilby粪便真菌组成差异：所有粪便样本测序获得373 551 reads，平均每样本14 942 reads，共371个真菌ASVs。释放前样本中0.77% reads仅分类到Kingdom Fungi，0.36%为incertae sedis；释放一个月后分别为0.51%和0.01%；释放三年后分别为36.36%和2.04%。粪便真菌以Basidiobolomycota（31.90%）、Basidiomycota（27.88%）和Ascomycota（17.96%）为主；腐生真菌占73.9%。ECM仅由1个ASV代表，出现在1个释放三年后粪便样本中，相对丰度1.80%，且该ASV也见于土壤。31个ASVs在所有三个采样期共享；已建立种群样本含160个独有ASVs。Wild Deserts粪便样本中296个ASVs有264个也见于土壤。属水平组成随采样期变化仅有弱统计支持（LRT，p=0.056）；功能类群组成随采样期显著不同（LRT，p=0.004），由凋落物腐生类群驱动（p=0.004）。Chlorophyllum在释放三年后相对释放前显著更高（log-fold change ± standard error = 5.89 ± 0.87），占该期粪便总真菌reads的30.4%，并在12个粪便中的6个超过20%样本内相对丰度；在土壤中则检测频率约12%，且占总真菌丰度<0.3%。

讨论部分总结

4.1 再引入挖掘哺乳动物存在下的土壤真菌群落：研究人员未检测到保护区内、外土壤真菌分类或功能指标的差异。与Clarke et al.、Decker et al.和Dundas et al.等研究相比，既往发现挖掘哺乳动物影响土壤真菌丰富度或功能类群的研究多在再引入至少15年后的保护地开展；Dundas et al.在已围栏20年的Karakamia Sanctuary发现影响，但在生态上类似的4年保护地未观察到影响。Wild Deserts调查时约3年，提示退化历史、表土侵蚀遗留和恢复时间可能决定真菌响应。土壤真菌恢复可能慢于细菌。该研究未检测到功能类群依赖效应，且菌根真菌很少，尽管采样植被以Acacia aneura为主，其已知可形成菌根；避免 rhizosphere 采样可能降低植物相关真菌检出。研究采用系统网格采样，并新颖应用Moran's I评估空间分布。数据为单一季节和单一恢复时间点的快照；采样前2020年降水量210.7 mm、2021年197.1 mm，高于1901–2022年长期年降水量中位数147.7 mm，植被覆盖增加，可能使挖掘哺乳动物的相对影响较弱。纵向监测有价值。

4.2 再引入Greater Bilbies粪便真菌内容：bilby粪便真菌组成随采样期出现差异，统计支持较弱，可能反映在Wild Deserts接触新真菌及再引入后饮食变化。已建立种群粪便267个ASVs中有235个也见于土壤；释放后粪便总ASVs的89.2%与土壤重叠，提示觅食时 incidental ingestion of soil 可能是粪便真菌的重要来源。释放三年后若干粪便中Chlorophyllum高丰度可能提示bilbies机会性直接取食子实体，但缺乏形态分析，不能确认。粪便真菌以腐生为主，释放后凋落物特化腐生菌更丰富。分子方法不能区分孢子与非存活DNA来源，且mycorrhizal真菌环境可用性低，可能限制bilby介导传播。样本量较小（25个粪便），季节差异也可能影响。

4.3 知识缺口：33.6%的ASVs无法鉴定（土壤837个，粪便26个），显示澳大利亚真菌分类数据库代表性不足，地理偏差影响干旱区真菌生态研究。全球气候变化下沙漠扩张和增暖可能降低真菌丰度和多样性。研究人员建议利用高通量测序扩展数据库，扩大干旱区空间采样，并结合系统发育分析未描述干旱区真菌。

研究结论翻译：理解土壤真菌群落如何响应环境变化，需要来自多个时间点的地点特异性数据；此类数据有助于更好区分由短期气候事件导致的真菌时间变异与对恢复处理或气候变化的长期响应。研究人员的研究提供了Wild Deserts在恢复早期阶段的真菌群落快照。尽管研究人员未检测到有挖掘哺乳动物存在与无挖掘哺乳动物存在区域之间土壤真菌群落的差异，但研究人员发现与再引入挖掘哺乳动物在Wild Deserts与环境真菌相互作用一致的证据。为增强未来研究就恢复景观中挖掘哺乳动物–真菌相互作用的机制和结果得出结论的能力，研究人员建议在多个时间段实施标准化粪便采集方案（以捕捉真菌环境可获得性的变化，例如季节间变化），强调需要进一步研究常见于再引入项目中哺乳动物粪便中孢子存活力，并指出在恢复轨迹中实施纵向土壤监测体系的价值。在Wild Deserts背景下，随着再引入挖掘哺乳动物种群增加以及该地土壤真菌开始从历史退化中恢复，研究人员预期它们在塑造真菌群落中将发挥更大作用；研究人员的数据可提供基线以追踪这些变化过程，随着其他物种被再引入，或评估土壤真菌对干旱或长期气候变化等事件的响应。通过此类长期、重复采样努力获得的知识可在更细尺度上告知保护管理者降解旱地土壤中土壤真菌群落变化的时间框架，以及挖掘哺乳动物如何通过恢复真菌介导的生态系统服务和直至微生物尺度的营养联系来促进整体生态系统恢复。