《Cancer Science》：A Novel Plasma Biomarker hsa_circ_0080018 Drives DLBCL Progression via M2 Polarization of Tumor-Associated Macrophages
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包括环状RNA（circular RNAs，circRNAs）在内的非编码RNA已被证明在肿瘤发生中发挥重要作用。揭示circRNAs在肿瘤发生中的功能及其潜在调控机制可能为开发人类癌症的新型诊断和治疗策略提供新途径。研究人员在此报道了hsa_circ-008
包括环状RNA（circular RNAs，circRNAs）在内的非编码RNA已被证明在肿瘤发生中发挥重要作用。揭示circRNAs在肿瘤发生中的功能及其潜在调控机制可能为开发人类癌症的新型诊断和治疗策略提供新途径。研究人员在此报道了hsa_circ-0080018在弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）进展中的重要作用及其在DLBCL肿瘤发生中的潜在影响。hsa_circ-0080018在新诊断的DLBCL患者血浆中显著上调，并可作为分类生发中心B细胞（GCB）和非生发中心B细胞（non-GCB）亚型的参考。hsa_circ-0080018的高表达也出现在血浆外泌体中，并可运输至肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）。此外，研究人员在分子水平上发现hsa_circ-0080018作为miR-625-5p的诱饵，通过抑制miR-625-5p调控肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）极化，从而激活IGF-1/IGF-1R通路。激活的IGF-1/IGF-1R促使巨噬细胞向M2极化，最终促进肿瘤进展。该结果提供了DLBCL血浆中一个与细胞起源（cell of origin，COO）相关的新型潜在生物标志物。circ-0080018在肿瘤进展中的机制是：血浆产生的circ-0080018通过外泌体递送至TME并推动巨噬细胞极化。该研究可能为未来DLBCL的治疗和预后提供新的靶点。
弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型，约占新发病例的25%，根据细胞起源（COO）可分为生发中心B细胞（GCB）与非生发中心B细胞（non-GCB）亚型，其中non-GCB患者经标准治疗后预后更差。目前一线治疗后复发或难治患者的预后仍不理想，临床上迫切需要新的生物标志物和治疗靶点。环状RNA（circRNA）在肿瘤发生中具有重要调控作用，但以往对circRNA在DLBCL中的研究较少且多局限于肿瘤组织，血浆来源的circRNA是否参与DLBCL恶性进程尚不清楚。同时，肿瘤微环境（TME）中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在DLBCL发病中的功能作用尚未阐明，外泌体递送circRNA的机制也缺乏研究。为此，研究人员开展了本研究，旨在筛选DLBCL血浆中的差异表达circRNA，并探讨其通过调控TAM极化影响肿瘤进展的分子机制。
研究人员通过circRNA微阵列分析发现，hsa_circ-0080018在DLBCL患者血浆中显著上调，并在大样本队列中验证了其诊断价值和与COO的相关性。进一步研究发现，hsa_circ-0080018可被包装进外泌体并递送至TME，作为miR-625-5p的海绵，解除miR-625-5p对IGF-1 mRNA的抑制，激活IGF-1/IGF-1R信号通路，驱动巨噬细胞向M2极化，从而促进DLBCL细胞增殖。该研究首次揭示了血浆circRNA通过外泌体调控TAM极化并推动DLBCL进展的新机制，为DLBCL诊断和靶向治疗提供了潜在的新靶点。
主要技术方法：研究人员收集2018至2023年山东大学齐鲁医院新诊断DLBCL患者外周血样本，使用CapitalBio Technology Human CircRNA Array V2进行circRNA微阵列筛选，并在109例DLBCL患者和50例正常对照中通过qRT-PCR验证。利用RNase R和放线菌素D处理鉴定circRNA环状稳定性；采用双荧光素酶报告实验验证circ-0080018与miR-625-5p、miR-625-5p与IGF-1的靶向结合；通过RNA免疫沉淀（RIP）验证AGO2结合；构建DLBCL细胞系与巨噬细胞共培养模型，结合流式细胞术、ELISA和Western blot检测巨噬细胞极化及IGF-1/IGF-1R通路；通过透射电镜、Western blot和粒径分析鉴定血浆外泌体。
研究结果：
3.1 DLBCL患者血浆中circRNA表达谱及差异表达circRNAs的验证：对3例DLBCL患者和3例健康对照血浆进行circRNA微阵列分析，共鉴定出3970个circRNA，其中136个差异表达（22个上调、114个下调）。经层级聚类和火山图筛选，选择6个上调circRNA在10例患者和10例对照中验证，最终确认hsa_circ-0080018差异表达最显著（p<0.001），并经Sanger测序确认其环状结构。
3.2 circ-0080018的特征：hsa_circ-0080018源自POLD2基因外显子13和部分外显子14，对RNase R和放线菌素D具有耐受性，且无poly-A尾，表明其是稳定的环状转录本。在多种造血系统疾病中，DLBCL血浆中circ-0080018表达水平最高。在109例DLBCL患者与50例正常对照中，DLBCL组表达显著升高（2.62倍），且仅60%正常对照可检出表达。
3.3 circ-0080018预测DLBCL患者侵袭性临床特征：受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，circ-0080018区分DLBCL患者与健康对照的曲线下面积（AUC）为0.82（95%CI=0.75–0.89，p<0.0001）。进一步分析发现，non-GCB患者血浆中circ-0080018表达显著高于GCB患者（p=0.0003），区分两者的AUC为0.71。但与乳酸脱氢酶（LDH）水平无显著相关性。
3.4 circ-0080018在DLBCL细胞系中的功能：RNA-FISH显示circ-0080018主要定位于细胞质；RIP实验证实其与AGO2蛋白结合，提示其可能作为miRNA海绵。双荧光素酶报告实验证实circ-0080018可直接结合miR-625-5p。在四种DLBCL细胞系中敲低circ-0080018后，miR-625-5p表达升高，但细胞计数和CCK-8实验显示细胞增殖无显著变化，表明circ-0080018不直接促进DLBCL细胞增殖。
3.5 circ-0080018在共培养系统中上调并促进巨噬细胞M2极化：将DLBCL细胞系与巨噬细胞共培养48小时后，共培养上清及巨噬细胞中circ-0080018表达显著升高，共培养的DLBCL细胞增殖明显加快。共培养巨噬细胞优先表达M2标志物（CD206、IL-10、CD163），而非M1标志物（IL-1β、iNOS）；流式细胞术显示共培养巨噬细胞更接近IL-10诱导的M2表型，ELISA检测到TNF-α、IL-6和IL-10分泌，免疫组化显示DLBCL肿瘤组织内CD163阳性细胞多于CD80。结果表明共培养环境促使巨噬细胞向M2极化，进而促进肿瘤生长。
3.6 circ-0080018调控巨噬细胞极化的分子机制：通过三个在线数据库预测并筛选出六个巨噬细胞相关的miR-625-5p候选靶基因，双荧光素酶报告实验证实IGF-1是miR-625-5p的直接靶标。在巨噬细胞中敲低circ-0080018后，IGF-1表达和分泌显著下降，IGF-1R及磷酸化IGF-1R蛋白水平降低，M2相关基因表达减少，而miR-625-5p抑制剂可逆转上述效应。相反，LPS加IFN-γ诱导的M1表型中IGF-1/IGF-1R表达低于M2表型。因此，circ-0080018通过海绵吸附miR-625-5p，激活IGF-1/IGF-1R通路，促进巨噬细胞M2极化。
3.7 外泌体将circ-0080018递送至DLBCL患者血浆：从30例DLBCL患者和10例正常对照血浆中分离外泌体，经透射电镜、Western blot（CD63、CD81、TSG101）和粒径分析确认外泌体特性。qRT-PCR显示DLBCL患者血浆外泌体中circ-0080018富集，共培养上清外泌体中也高表达，且其水平受circ-0080018敲低和miR-625-5p抑制剂影响。表明外泌体介导circ-0080018从血浆到TME的运输。
讨论部分总结了本研究的核心发现：circ-0080018在DLBCL患者血浆中富集并可用于区分COO亚型；它不直接驱动肿瘤细胞增殖，而是通过外泌体递送至TME，作为miR-625-5p海绵解除对IGF-1的抑制，激活IGF-1/IGF-1R通路，促使巨噬细胞M2极化，最终促进DLBCL进展。研究局限性包括微阵列发现队列样本量较小（n=3），且采用GAPDH作为血浆circRNA内参可能不是最优选择，未来需要更大规模多中心队列和更稳健的标准化策略进一步验证。
研究结论：本研究首次证明circ-0080018在DLBCL患者血浆中富集，其表达与COO相关。过表达的circ-0080018通过外泌体递送至TME，作为miR-625-5p海绵激活IGF-1/IGF-1R信号通路，驱动巨噬细胞M2极化，最终促进DLBCL细胞增殖。这些发现为DLBCL的诊断和未来靶向治疗提供了新的方向和靶点。
