髓系选择性IL-10受体激动剂：基于TYK2依赖性与受体几何构象的细胞类型选择性细胞因子信号工程

《Nature》：Engineered TYK2 dependence enables myeloid-selective IL-10 receptor agonism

　　

白细胞介素-10（IL-10）是一种核心抗炎细胞因子（cytokine），可在髓系细胞（myeloid cells）中抑制免疫反应，但也可激活T细胞，因其治疗窗窄和剂量限制性毒性，在慢性炎症性疾病中的治疗应用受限。研究人员利用髓系细胞与T细胞在IL-10信号传导中对Janus激酶（JAK）家族激酶配对依赖性的差异，构建了四价纳米抗体（nanobody）类髓系选择性IL-10受体激动剂（msIL-10R agonist）。该分子完全重现IL-10对单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的强效抑制，同时不刺激T细胞。冷冻电镜（cryo-EM）分析显示其与天然IL-10家族细胞因子具有不同受体交联几何结构。该四价结构使信号传导严格依赖酪氨酸激酶2（TYK2），并对IL-10Rα与IL-10Rβ丰度高度敏感，从而在髓系细胞中产生选择性。该激动剂在人源化小鼠的脂多糖（LPS）攻击、迟发型超敏反应和结肠炎模型中减轻炎症；人源化版本在食蟹猴中具有IgG样药代动力学、持续受体占有率和长达30天的髓系抑制，且无T细胞激活或血液学毒性。该研究确立基于几何结构的细胞类型选择性细胞因子信号策略，并将msIL-10R agonist确定为髓系驱动炎症性疾病包括炎症性肠病（IBD）的治疗候选。

该研究发表于《Nature》。IL-10是维持免疫耐受的核心抗炎细胞因子，其丢失或受体IL-10Rα（由IL10RA编码）、IL-10Rβ（由IL10RB编码）功能缺失可导致早发炎症性肠病与自身炎症性疾病。IL-10通过结合IL-10Rα与IL-10Rβ形成四聚体受体复合体，该复合体分别组成性关联Janus激酶1（JAK1）与TYK2，触发JAK1依赖的IL-10Rα与信号转导及转录激活因子3（STAT3）磷酸化，抑制促炎基因表达。IL-10主要作用于单核细胞、巨噬细胞与树突状细胞等抗原提呈细胞，抑制细胞因子产生、抗原提呈与T细胞启动。

目前存在的主要问题是：IL-10具有双重功能，低浓度强效抑制髓系炎症，高浓度则可激活T细胞、促进干扰素γ（IFNγ）依赖的紧急髓系生成，并引起血小板与红细胞减少；早期克罗恩病与银屑病临床试验显示治疗窗窄，出现贫血与血小板减少等剂量限制性毒性；聚乙二醇化IL-10作为肿瘤免疫治疗药物又依赖其T细胞刺激作用，因此IL-10免疫抑制与免疫刺激效应及血液学毒性共同导致治疗指数有限。既往工程化IL-10变体受限于半衰期短、免疫原性以及有益与有害活性分离不完全。

研究人员通过开展以下研究得出核心结论：髓系细胞与T细胞对IL-10信号中TYK2依赖程度不同；研究人员利用该差异构建四价纳米抗体msIL-10R agonist，其通过独特受体交联几何结构使信号严格TYK2依赖，并对IL-10Rα/IL-10Rβ表面拷贝数高度敏感，从而只在髓系细胞产生强效抗炎信号，而不激活T细胞与B细胞。该分子在人源化小鼠炎症模型中有效，在食蟹猴中药代长、受体占有持久且无明显血液学毒性，为IBD等髓系驱动炎症疾病提供新治疗候选。

作者开展研究用到的主要关键技术方法如下：使用选择性JAK1别构抑制剂VVD-118313与ATP竞争型JAK1抑制剂upadacitinib及TYK2抑制剂zasocitinib进行药理学阻断；采用CRISPR介导TYK2、JAK1等基因敲除；通过羊驼免疫人IL-10Rα/IL-10Rβ胞外域（ECD）构建VHH噬菌体库并高通量筛选四价纳米抗体；以STAT3荧光素酶报告系统评估激动活性；使用冷冻电镜解析IL-10Rα–IL-10Rβ–串联VHH复合体结构；通过RNA测序分析人PBMC与T细胞转录组；样本包括健康供体外周血单核细胞、单核细胞来源巨噬细胞、CD8⁺ T细胞，人IL10RA/IL10RB敲入小鼠，以及食蟹猴体内研究。

细胞特异性TYK2依赖。研究人员在小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中发现JAK1–JAK1转磷酸化被抑制后仍可经TYK2补偿维持STAT3磷酸化与功能；TYK2缺陷时VVD-118313完全废除信号。人单核细胞中TYK2抑制仅部分降低STAT3磷酸化但不损害LPS诱导TNF与IL-6抑制。CD8⁺ T细胞中TYK2抑制或敲除则明显削弱IL-10诱导的STAT3磷酸化并完全取消颗粒酶B与IFNγ增强。工程化IL-10单体只激活单条TYK2–JAK1通路，在单核细胞保留部分抗炎活性，在T细胞不引起STAT3磷酸化与细胞毒效应。结论：髓系细胞可容忍衰减信号，T细胞需最大信号，这种细胞类型阈值差异可被用来分离髓系抑制与T细胞刺激。

髓系选择性IL-10R激动剂。研究人员从882个四价纳米抗体组合中筛选出E07-A05/E07-A05分子，即msIL-10R agonist。其对人IL-10Rα亲和力K_D=2.8 nM，对IL-10Rβ亲和力K_D=1.1 nM；在PBMC中抑制LPS诱导TNF的IC₅₀为2.1 pM、IL-6为6.9 pM，且不诱导CD8⁺ T细胞IFNγ或颗粒酶B，也不促进B细胞增殖。RNA-seq显示该分子在静息与LPS刺激PBMC中重现IL-10对CSF3、IL6、PTGES等炎症基因的抑制，但在活化T细胞中不诱导GZMB、BCL6等细胞毒相关基因。结论：高通量纳米抗体筛选可获得既保留髓系抗炎程序又解除淋巴细胞刺激的IL-10R激动剂。

IL-10R激动的结构基础。冷冻电镜解析显示msIL-10R agonist由抗IL-10Rα VHH E07与抗IL-10Rβ VHH A05串联并经Fc支架形成四价结构。A05结合IL-10Rβ时使Asn138–Trp143环重排，E07结合IL-10Rα两个纤连蛋白III型结构域连接处，表位不同于天然IL-10结合面及IBD相关IL10RA突变位点。该分子在R117C、R117H、Y64C等致病IL10RA变异细胞中仍保留功能，而天然IL-10与亲和力的IL-10 mutein（10DE、D25K）活性受损。改变E07-A05连接子长度、反转串联拓扑或采用对称A05-A05/E07-E07都会改变活性与选择性，说明受体交联几何决定信号输出与细胞选择性。

IL-10R拷贝数驱动选择性。研究人员发现msIL-10R agonist信号严格TYK2依赖；TYK2敲除或抑制可完全取消巨噬细胞STAT3磷酸化与抗炎功能，而pan-IL-10R agonist等非选择性四价分子在TYK2缺失细胞中仍保留部分STAT3信号。髓系细胞表面IL-10Rα与IL-10Rβ拷贝数高于T、B、NK细胞2至18倍；在CD8⁺ T细胞过表达IL-10Rα或IL-10Rα+IL-10Rβ可恢复msIL-10R agonist信号并诱导颗粒酶B。研究人员进一步构建靶向IL-10Rα与IL-2Rγ的双特异性纳米抗体，可将STAT3/STAT1信号转向T与NK细胞，证明受体相对丰度与配对可工程化决定细胞类型选择性。

msIL-10R agonist抑制炎症。该分子抑制GM-CSF驱动单核细胞向CD1a⁺ DC分化，抑制zymosan刺激DC释放TNF与IL-23，削弱肽脉冲DC对HA-tetramer⁺ CD4⁺ T细胞扩增，并抑制免疫复合物经FcγR信号诱导的巨噬细胞TNF。人IL10RA/IL10RB敲入小鼠中，LPS攻击后该分子与IL-10–Fc等效抑制血清TNF、IL-6、IL-12；KLH/alum迟发型超敏反应中减少耳肿胀、淋巴结中性粒细胞浸润与KLH特异性IFNγ/TNF回忆反应；DSS结肠炎中改善结肠重量长度比、降低脾中性粒细胞并下调结肠Tnf、Il1b、Csf3r表达。食蟹猴中人源化版本具约8天终末半衰期、单次给药后全血LPS刺激TNF抑制超3周，不升高IL-18，也无贫血、血小板减少等血液学异常。

讨论部分总结：研究人员提出IL-10R信号后TYK2需求具有细胞类型特异性，髓系细胞在TYK2缺失或部分STAT3信号减弱时仍保留抗炎反应，T细胞则更依赖TYK2与最大通路激活。纳米抗体对受体几何的操控可精细调节pSTAT3信号强度，使msIL-10R agonist形成独特四价交联，从而严格TYK2依赖并对受体密度敏感。与通过破坏IL-10Rβ结合进行亲和力调谐的IL-10 mutein不同，该分子不依赖天然细胞因子界面，可在天然配体结合界面突变的IL10RA疾病背景中保持信号，并因序列与IL-10无同源而有望规避IBD中抗IL-10自身抗体中和。其意义在于为IBD及髓系驱动炎症疾病提供保留抗炎效力、降低历史靶向毒性的精准IL-10疗法，也为细胞类型选择性细胞因子激动剂/拮抗剂设计提供通用蓝图。

研究结论部分翻译：此处研究人员描述一种全合成髓系选择性IL-10受体激动剂，其重现IL-10在单核细胞、巨噬细胞与树突状细胞中的强效免疫抑制活性，同时解除历史上限制IL-10治疗的T细胞刺激效应。该研究揭示IL-10R信号下游TYK2具有细胞类型特异性需求；髓系细胞在TYK2缺陷与STAT3信号部分衰减时仍保留抗炎反应，T细胞则高度依赖TYK2活性与最大通路激活。四价架构使msIL-10R agonist具有区别于天然IL-10家族细胞因子的受体交联模式，信号严格TYK2依赖且对受体密度高度敏感。髓系细胞高表达IL-10Rα与IL-10Rβ，可实现高效受体聚集；T、B细胞较低受体丰度不足以达到生产性信号所需亲合力阈值。该工作确定TYK2在IL-10R信号中的细胞类型特异性需求源于受体丰度与信号阈值差异，并由此工程化出在保留完整抗炎效力的同时显著降低历史靶向毒性的精准IL-10治疗药物；msIL-10R agonist成为IBD及其他髓系驱动炎症性疾病的差异化治疗候选，其工程原则可为免疫学与肿瘤学中细胞类型选择性细胞因子激动剂及拮抗剂提供可推广框架。