脂质纳米颗粒介导肺肿瘤转移的配体身份之争：内源性mtDNA假说还是细菌污染假说？——对LNP免疫毒理学检测方法与监管临床意义的审视

《Nano Today》：Opinion: Ligand identity ambiguity in LNP-induced metastasis promotion via TLR9-MyD88/cGAS-STING-dependent NETosis – Endogenous mtDNA or exogenous bacterial PAMPs?

　　

摘要

Wang 及其同事最近报道，脂质纳米颗粒 (LNP) 给药通过 TLR9-MyD88- 和 cGAS-STING 介导的中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 形成，促进实验性肺肿瘤转移，主张坏死肌肉细胞释放的线粒体 DNA (mtDNA) 作为激活配体。本文观点挑战了该解释背后的一个基本假设：因为 TLR9 识别 mtDNA 和细菌 DNA 共有的未甲基化 CpG 二核苷酸，且 cGAS 以序列非依赖方式检测双链 DNA，遗传拯救实验同样与 LNP 制剂中的细菌核酸或脂多糖 (LPS) 污染相符。标准内毒素检测方法，包括鲎血裂解物 (LAL) 试验，在脂质基质中已被证明是不可靠的，因为在这些基质中，LPS 的脂质 A 部分会稳定插入疏水区域并逃避检测。需要通过 EndoQuant 进行总脂质 A 定量（酸水解/HPLC-MS/MS）、16S rDNA 分析、多粘菌素 B 预处理和扩增子测序来解决配体身份问题。在这些对照应用之前，mtDNA 假说和制造污染假说同样得到可用数据的支持——这一区别对基于 LNP 的疗法具有截然不同的监管和临床意义。

Wang 及其同事报道，脂质纳米颗粒 (LNP) 给药通过 TLR9-MyD88- 和 cGAS-STING 介导的中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 形成，增强实验性肺肿瘤转移，提议坏死肌肉细胞释放的线粒体 DNA (mtDNA) 作为激活配体 [1]。使用 Tlr9?/?、MyD88?/? 和 Sting?/? 小鼠进行的遗传验证，结合药理学 NET 形成抑制，构成了实质性的机制贡献。然而，一个基本问题仍未通过呈现的数据解决：TLR9 激活配体是内源性 mtDNA，还是 LNP 制剂本身的细菌核酸和脂多糖 (LPS) 污染——这一区别具有截然不同的监管和临床意义。

配体身份问题

TLR9 识别未甲基化 CpG 二核苷酸——这是 mtDNA 和细菌 DNA 共有的分子特征，反映了线粒体的 α-变形菌进化起源 [2]。cGAS 以序列非依赖方式识别双链 DNA，且无法区分胞质中的线粒体和细菌来源 [3]。因此，每一项 Tlr9?/?、MyD88?/? 和 Sting?/? 拯救实验同样与 LNP 制剂中的细菌 DNA 污染相符，也与内源性 mtDNA 相符。基因敲除数据确立了通路依赖性——它们并未确立配体身份。未报道任何内毒素检测、LNP 制剂的广谱 16S rDNA 定量、多粘菌素 B 对照，以及血清 qPCR 扩增产物测序以确认其线粒体来源。这些是纳米颗粒免疫毒理学中的标准对照 [4]。

脂质基质中检测 LPS 的根本问题

通过标准方法可靠检测脂质制剂中 LPS 的不可能性并非新近担忧——这在三四十年前针对经典磷脂脂质体就已确立 [5]，并以叠加效应适用于现代可电离 LNP。LPS 是一种两亲性脂质 - 多糖，其脂质 A 部分会自发且稳定地插入疏水脂质区域。一旦结合，脂质 A 在物理上无法被鲎血裂解物 (LAL) 试验的 Factor C 级联反应接触。这些问题在可电离 LNP 中更为复杂，它们具有斑驳不连续的表面单分子层、液晶核、氢键稳定的 mRNA-脂质复合物以及 pH 依赖的中相转变 [6]。因此，标准 LAL 测试无法排除具有生物学意义的 LPS 污染。

粗糙型 LPS——革兰氏阴性菌发酵产生的主要物种，缺乏 O-抗原链——是最有效结合的物种。在内体逃逸后，它可与 mRNA 货物共同递送进入胞质，独立于 TLR4 激活 caspase-4/5 和 NLRP3 [7]、[8]。唯一经验证能够量化脂质基质中总脂质 A 内容的方法是 EndoQuant 试验（酸水解后对 3-羟基十四烷酸进行 HPLC-MS/MS 定量）[9]。未报道对 Wang 等人使用的 LNP 制剂进行 EndoQuant 测量。关键的是，具有生物学相关浓度的 LPS 不仅通过 TLR4，还通过诱导线粒体膜电位崩溃、ROS 生成和继发性 mtDNA 泄漏进入胞质来间接激活 cGAS-STING——这一通路已在人基质细胞中得到证实，使得两种提出的配体情景在机制上无法分离 [10]。

作为 mRNA-LNP 制造文档化污染物的细菌 DNA 和 LPS

对于 Comirnaty，监管文件中确认了用于质粒 DNA 扩增的大肠杆菌发酵 [11]——这是 LPS 和细菌染色体 DNA 的已知来源。BioNTech 自己的科学家明确承认残留 DNA 模板是体外转录制造过程的固有副产品 [12]。独立分析在商业小瓶中检测出残留质粒 DNA，水平大幅超过监管限制，通常封装在 LNP 内 [13]。这些结构含有未甲基化 CpG 基序——正是 TLR9 激活所需的精确特征。Wang 等人使用的实验室合成 LNP 缺乏报道的内毒素规格，使得批次变异成为一个合理的混杂因素。

转化考虑

使用商业 Comirnaty 的猪研究表明，在人类相关暴露量下表现出快速的类 CARPA 固有免疫激活和多器官 mRNA 分布，但同样缺乏总脂质 A 表征 [14]。Wang 等人使用的超生理 LNP 脂质剂量（~12 mg/kg）比人类临床暴露高出几个数量级。鉴于小鼠系统与人类/猪系统在病原体相关分子模式 (PAMPs) 固有免疫敏感性方面存在超过 10? 倍的差异，这一点尤为关键 [15]。

利害关系是什么？

内源性 mtDNA 释放将代表 LNP 肌毒性的内在、剂量依赖性后果。细菌 DNA 和 LPS 污染将代表可缓解的制造质量控制问题。这些情景预测了根本不同的剂量 - 反应关系、物种敏感性谱和监管策略。我建议作者以及所有使用商业修饰 RNA (modRNA) 疫苗或空 LNP 的研究人员，对所有配方应用 EndoQuant 总脂质 A 定量和 16S rDNA 分析，制备去污染对照品，纳入多粘菌素 B 预处理，并对推定的 mtDNA 扩增子进行测序。在配体身份通过化学和测序严谨性得到解决之前，mtDNA 假说仍然是对否则严谨的遗传通路数据的两种同等支持的解读之一。

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Hartmut H. Glossmann

奥地利因斯布鲁克医科大学生化药理学研究所