宽叶大叶藓（Rhodobryum laxelimbatum）线粒体基因组特征及其与叶绿体基因组的RNA编辑与密码子使用偏好比较分析

《Ecology and Evolution》：Mitochondrial Genome Characteristics of Rhodobryum laxelimbatum and Comparative Analysis of RNA Editing and Codon Usage Bias With the Chloroplast Genome

摘要专业翻译 宽叶大叶藓（Rhodobryum laxelimbatum）是一种隶属于大叶藓属（Rhodobryum）的传统药用植物。迄今为止，对该属的研究主要集中于其地理分布、化学成分及生物活性，而该属的基因组数据十分有限。研究人员对宽叶大叶藓的线粒体基因组进行了测序、组装和注释，并系统表征了其基因组结构特征及简单序列重复（simple sequence repeats, SSRs）。利用该物种的线粒体基因组与叶绿体基因组，开展了RNA编辑模式及密码子使用偏好的比较分析。结果表明，宽叶大叶藓完整的线粒体基因组长度为103,071 bp，包含40个蛋白质编码基因（其中Nad7为假基因）、24个转运RNA（transfer RNA, tRNA）基因和3个核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）基因。共检测到76个SSR位点。线粒体基因组与叶绿体基因组分别包含189个和608个RNA编辑位点，其中亲水性氨基酸向疏水性氨基酸的转换占主导地位。两个细胞器基因组均在第一密码子位点表现出最高的GC含量。仅在叶绿体中，GC12与GC3呈显著相关，且回归趋势更为陡峭。线粒体基因的有效密码子数（effective number of codons, ENC）变异更大，且两个基因组的大多数基因聚集在预期ENC曲线附近。奇偶规则2（Parity Rule 2, PR2）作图分析揭示了同义第三密码子位点存在明显的碱基组成不平衡——线粒体表现为T3s > A3s且G3s与C3s相当，而叶绿体表现为T3s > A3s且G3s > C3s。在线粒体基因组中鉴定出5个最优密码子，主要以其末端为G/A/C为特征；而在叶绿体基因组中鉴定出9个最优密码子，其末端为A/U。对应分析表明，密码子使用偏好是由多种相互作用因素共同塑造的，而非单一因素决定。该研究为阐明大叶藓属（Rhodobryum）细胞器基因组的进化模式、理解其遗传特征及分子基础提供了关键证据。

论文解读

一、研究背景与意义

宽叶大叶藓（Rhodobryum laxelimbatum）隶属于大叶藓属（Rhodobryum，真藓科Bryaceae，真藓目Bryales，真藓纲Bryopsida），是一种传统药用苔藓植物。该属多数物种为药用苔藓，如同属的R. roseum和R. giganteum被称为著名中药“回心草”，含有氨基酸、有机酸、酚类化合物和黄酮类等多种化学成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗心肌缺血、降脂和抗动脉粥样硬化等药理活性，可用于心悸、冠心病、高血压、神经衰弱及相关疾病的临床治疗。尽管缺乏宽叶大叶藓药理活性和药效学的直接实验数据，但现有文献表明其与同属物种具有相似的传统药用功效，同样被视为重要的药用苔藓。

迄今为止，对该属植物的研究主要集中于地理分布、系统分类、化学成分和药理活性，而基因组学研究相对薄弱。完整的基因组数据包含核基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组三个遗传组分，后两者位于细胞器内，统称为细胞器基因组。与核基因组相比，细胞器基因组结构相对简单，是众多研究的优先对象。随着分子研究的快速发展，高等植物已成为主要实验模型，而苔藓植物的基因组研究仍然有限。作为模式苔藓，小立碗藓（Physcomitrella patens）是首个完成细胞器基因组全面分析的苔藓物种。随后，多种苔藓的完整线粒体基因组相继获得，揭示了基因组组成、基因顺序和内含子组成的高度保守性。

大叶藓属物种的基因组测序可追溯至2019年，研究人员利用基因捕获技术对包括Rhodobryum ontariense在内的142种植物核基因组蛋白质编码区进行了测序，阐明了主要苔藓谱系的系统发育关系，为该属的进化研究提供了宝贵的分子资源。然而，由于缺乏完整组装的细胞器基因组，对大叶藓属细胞器基因组进化的全面系统评估尚未实现。研究人员此前已报道了宽叶大叶藓的完整叶绿体基因组，随后Rhodobryum giganteum的叶绿体基因组也被测序分析，系统发育结果将R. giganteum稳健地置于真藓目内，与宽叶大叶藓形成紧密的姐妹关系。但该属任何物种的线粒体基因组数据仍然缺失。线粒体基因组数据的缺乏以及双细胞器基因组的比较分析空白已成为制约大叶藓属基因组研究的关键瓶颈。本研究获得宽叶大叶藓的线粒体基因组，并比较其与叶绿体基因组之间的RNA编辑和密码子使用偏好，将有助于对大叶藓属进行更系统和深入的研究，为后续阐明该物种的遗传背景和进一步探索相关调控机制提供有价值的见解。

二、主要技术方法

研究人员采集了来自中国云南省香格里拉哈巴雪山的宽叶大叶藓标本（凭证标本存放于河北师范大学标本馆，采集人Shuo Shi，标本号SZ5212，2016年9月19日），经硅胶干燥保存后，从约5 mg绿色营养组织中提取DNA。在Illumina HiSeq X Ten平台上进行150 bp双端测序，获得超过5.4 Gb的原始数据。使用FastQC进行质量评估，fastp进行接头修剪和质量过滤，采用GetOrganelle v1.7.7.1（以SPAdes为核心组装器，embplant_mt为种子参考数据库）进行组装，组装线粒体基因组平均覆盖深度为307.8×。使用Geneious Prime 2025.0.2以近缘物种Mielichhoferia elongata（GenBank登录号NC_036945.1）为参考进行蛋白质编码基因和rRNA基因注释，tRNA基因使用tRNAscan-SE v2.0预测。使用OGDRAW绘制环形基因组图谱，PhyloSuite v2进行基本基因组特征分析，ORF Finder鉴定基因间隔区中的开放阅读框（open reading frame, ORF），并通过本地BLASTN搜索检测外源序列。SSR分析使用MIcroSAtellite identification tool（MISA）进行。RNA编辑位点使用PREPACT v3.12.0以小立碗藓的线粒体（NC_007945.1）和叶绿体（NC_005087.1）基因组为参考进行预测。密码子使用偏好分析使用PhyloSuite v2内置的CodonW 1.4.2插件和MEGA软件，涵盖中性绘图分析、ENC–GC3s绘图分析、PR2绘图分析、最优密码子筛选和对应分析等方法。

三、研究结果

3.1 宽叶大叶藓线粒体基因组特征

组装的宽叶大叶藓线粒体基因组长度为103,071 bp，包含40个蛋白质编码基因（其中Nad7为假基因）、24个tRNA基因和3个rRNA基因。基因序列总长70,419 bp，占全基因组的68.32%；外显子39,107 bp（37.94%），内含子31,312 bp（30.38%），基因间隔区32,668 bp（31.69%）。基因GC含量为40.99%，略高于全基因组GC含量（39.8%），而基因间隔区GC含量较低（37.24%）。鉴定出三对重叠基因：atp4与atp8重叠8 bp，cox1与atp4重叠4 bp，核糖体蛋白S12与S7重叠4 bp。线粒体基因组含有3个I型内含子和22个II型内含子，cox1和nad5的内含子中分别存在ORF622（1869 bp）和ORF533（1602 bp）两个≥300 bp的ORF。64个基因间隔区中有38个≥300 bp，但未检测到ORF。48个≥50 bp的基因间隔区经本地BLASTN搜索未发现叶绿体来源的外源序列，而鉴定出26个核来源序列，共8,625 bp，占完整线粒体基因组的8.37%。共检测到76个SSR，其中单核苷酸重复最丰富（34个，44.74%），其次为二核苷酸（23个，30.26%）、四核苷酸（11个，14.47%）、复合型（5个，6.58%）、三核苷酸（2个，2.63%）和五核苷酸（1个，1.32%）。单核苷酸重复以A和T碱基为主，二核苷酸重复以（AT）基序为主，（AT）_n为优势SSR类型。

3.2 叶绿体和线粒体基因组的RNA编辑位点

线粒体基因组共包含189个RNA编辑位点，其中以C-to-U转换为多数（128个位点）。不同基因间的编辑位点分布差异显著，细胞色素c生物发生相关线粒体基因ccmFc和ccmFN的编辑位点数量相对较高，其次为nad5和sdh3。叶绿体基因组预测的RNA编辑位点数量显著更高（608个），其中C-to-U和U-to-C编辑事件数量相当，分别为318个和290个。ycf2和ycf1基因的编辑位点频率最高，其次为RNA聚合酶β亚基2和成熟酶K。线粒体和叶绿体基因组均鉴定出28种氨基酸转变类型，以亲水性氨基酸向疏水性氨基酸的转换占主导。

3.3 叶绿体和线粒体基因组的密码子偏好及影响因素分析

共对28个线粒体和52个叶绿体蛋白质编码序列进行了密码子使用偏好分析。两个细胞器基因组均在第一密码子位点表现出最高GC含量，其次为第二位点，第三密码子位点GC含量最低，整体密码子使用偏好A/T。

中性绘图分析： 线粒体基因组中，各基因GC₃含量分布范围较窄（约0.175–0.318），基因未沿对角线分布，GC₃与GC₁₂的回归曲线近乎平行，相关系数为0.018，双尾检验无显著相关性，表明线粒体蛋白质编码基因第一、第二和第三密码子位点间碱基组成存在差异。叶绿体基因组中，GC₃含量范围为0.074–0.302，显著低于线粒体，psbA基因的GC₃值（0.346）显著高于其他基因，GC₁₂与GC₃的相关系数为0.336，双尾p值<0.05，表明两者存在显著相关性。

ENC–GC3s绘图分析： 两个基因组的大多数ENC值分布在预期ENC曲线之上或附近，部分基因位于预期曲线下方。两个细胞器的ENC比值分布模式相似：最大比例的值位于?0.05至0.05区间，其次分布于0.05至0.15区间。线粒体基因组ENC值分布范围更宽，几乎所有ENC值高于35；叶绿体ENC值分布范围较窄、密码子偏好变异较小，但ENC值低于35的基因数量显著多于线粒体。

PR2绘图分析： 线粒体基因组中，大多数点在垂直方向上位于区域下半部，表明同义位置T的使用频率高于A；水平方向上左右区域基因数量差异较小，表明同义位置G和C的频率相似。叶绿体基因组在垂直方向呈现相似的分布特征，但水平方向上右侧区域的基因散点显著多于左侧，反映了第三密码子位点T > A和G > C的显著偏好。

最优密码子筛选： 线粒体基因获得5个最优密码子（UUG、CCC、AAA、AGC和GGC），叶绿体基因组鉴定出9个最优密码子，全部以A或U结尾，与陆地植物叶绿体的一般模式一致。

对应分析： 线粒体基因组前四个主轴的变异贡献分别为12.57%、10.94%、9.01%和8.83%，累计贡献41.35%；叶绿体基因组前四个轴的贡献分别为15.06%、7.54%、7.32%和5.87%，累计贡献35.79%。线粒体基因组中，大多数核糖体蛋白编码基因与原点明显分离。叶绿体基因组中，大多数基因集中在零坐标附近，psbA基因显著偏离大多数基因。相关性分析显示，线粒体基因组第二轴与ENC和GC3s显著相关；叶绿体基因组第一轴与CAI、Fop、GC3s和GC显著相关，第二轴与Gravy值呈显著负相关。

四、讨论与结论

讨论部分指出，宽叶大叶藓线粒体基因组的大小和GC含量与已测序的其他苔藓植物线粒体基因组相似。nad7假基因化的发现值得关注：该物种属于非基部苔藓谱系（真藓目），此前预期不应发生nad7假基因化，但研究结果证实其存在，这与M. elongata中的报道一致，进一步支持了nad7基因功能丧失在苔藓进化过程中至少独立发生两次的假说。内含子组成与其他苔藓基本一致，仅缺失与nad7基因功能受损相关的两个内含子，而基部苔藓谱系中存在的特定内含子在进化分化过程中逐渐丢失。未检测到叶绿体来源的外源序列，核来源序列占8.37%，显著低于被子植物和其他苔藓物种的报道值。线粒体重复序列局限于内含子且≤100 bp，表明重排潜力较弱。基于先前总结的更适合引物设计的SSR标准，鉴定出7个可靠的SSR位点。

RNA编辑方面，叶绿体基因组预测的编辑位点数量显著高于线粒体，这与陆地植物中“线粒体编辑位点通常多于叶绿体”的传统认知相矛盾，也与大多数苔藓物种的编辑特征存在显著差异。作为进化上古老的苔藓植物，宽叶大叶藓可能保留了高丰度的RNA编辑事件以稳定正常基因表达和生理功能。两个细胞器基因组中RNA编辑后占主导的氨基酸转换类型均为亲水性向疏水性氨基酸的转变，与先前其他植物物种的研究结果一致。

密码子使用分析表明，线粒体蛋白质编码基因的GC12与GC3无显著相关性，反映自然选择对线粒体密码子组成的强烈约束；叶绿体基因组中GC12与GC3显著相关，表明突变压力对塑造叶绿体密码子使用偏好有显著贡献，但9个A/U结尾的最优密码子的存在也表明翻译相关的自然选择参与其中。线粒体最优密码子以C结尾为主，与全基因组碱基组成背景不一致，进一步支持了高表达线粒体基因受翻译选择调控的观点。对应分析揭示线粒体密码子变异主要由密码子偏好程度和同义第三位碱基组成驱动，而叶绿体密码子变异受翻译效率、碱基组成和蛋白质疏水性影响。总之，该物种线粒体和叶绿体基因组的密码子使用偏好由突变压力和自然选择共同塑造，但两者的相对贡献和主要调控因素存在显著差异。

结论部分：本研究呈现了宽叶大叶藓的完整线粒体基因组，阐明了其基因组大小、GC含量、基因组成、内含子谱、重复序列和SSR位点。从双细胞器视角进行的部分比较分析揭示，宽叶大叶藓叶绿体基因组预测的RNA编辑位点远超线粒体，而细胞器间整体密码子使用偏好相对较弱且受多种进化因素调控。这些发现为进一步阐明该物种叶绿体和线粒体之间的转录后调控差异以及理解细胞器基因组的进化机制提供了重要的理论支持。