高北极快速变暖背景下人为热点与野生脊椎动物塑造微孢子虫多样性及人兽共患风险

《Environmental DNA》：Anthropogenic Hotspots and Wild Vertebrates Shape Microsporidian Diversity and Zoonotic Risk in a Rapidly Warming High Arctic

　　

摘要 北极地区正经历由气候变化和直接人为压力共同驱动的快速环境转型，这可能对野生动物—人类界面上的病原体传播产生影响。在此背景下，微孢子虫（Microsporidia）——一类专性细胞内寄生虫，包含多种具有全球健康意义的人兽共患物种——构成了特别值得关注的类群。然而，它们在快速变暖的极地生态系统中的分布和流行病学意义仍知之甚少。本研究调查了来自斯瓦尔巴群岛（Svalbard Archipelago）九个地点（包括受人类影响的定居点和偏远自然区域）的北极狐（Vulpes lagopus）、斯瓦尔巴驯鹿（Rangifer tarandus platyrhynchus）和白颊黑雁（Branta leucopsis）的1467份粪便样本中微孢子虫DNA的多样性和出现情况。研究人员采用基于扩增子的下一代测序（amplicon-based next-generation sequencing, NGS）技术，靶向小亚基核糖体RNA基因（SSU rRNA gene）的V5区域，以检测和表征微孢子虫物种。微孢子虫DNA在10.77%的样本中被检出，产生了10个独特的扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs），推定归属于三个主要微孢子虫谱系的物种。由于粪便宏条形码（fecal metabarcoding）可检测环境DNA，这些检出可能既反映肠道感染，也可能反映摄入孢子的存在。值得注意的是，三个ASV与注释为人兽共患物种Enterocytozoon bieneusi、Encephalitozoon cuniculi和Enc. hellem的参考序列具有100%的序列一致性。在受人类影响区域，人兽共患微孢子虫DNA阳性样本的比例（4.01%）显著高于偏远地区（0.79%）。多变量分析揭示了与人为热点相关的人兽共患微孢子虫群落的显著空间结构。这些发现表明，快速变暖的北极生态系统并非与全球分布的人兽共患微孢子虫隔绝，并提示人类活动和候鸟可能促成了它们的引入和环境持续存在。在气候变化持续背景下，有必要在极地野生动物—人类界面上继续开展微孢子虫监测，以评估潜在公共卫生影响。

高北极微孢子虫多样性与人兽共患风险研究解读

一、研究背景与科学问题

北极地区正经历全球最快的环境变化之一，斯瓦尔巴群岛（Svalbard Archipelago）作为高北极的代表性区域，其温度上升速率位居环北极地区前列，导致冰川消退加速、环境胁迫加剧，并对特有物种产生负面影响。与此同时，日益增长的旅游业活动、永久定居点（如朗伊尔城Longyearbyen和尼奥勒松Ny-?lesund）的存在，以及候鸟的季节性迁徙，共同构成了该区域生态系统的额外压力源。斯瓦尔巴群岛仅拥有三种本地常驻陆生脊椎动物——北极狐（Vulpes lagopus）、斯瓦尔巴驯鹿（Rangifer tarandus platyrhynchus）和斯瓦尔巴岩雷鸟（Lagopus muta），物种丰富度相对较低，群落结构相对简单，因此成为研究人类活动对野生动物和寄生虫传播影响的理想模型系统。

微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生虫，包含约1700个已描述物种，其中至少17个物种被认定为具有医学和兽医学意义的病原体。特别是Enterocytozoon bieneusi、Encephalitozoon cuniculi和Enc. hellem已在多种家养和野生动物中被检出，提示其具有广泛的宿主范围和潜在的人兽共患传播能力。然而，此前关于极地微孢子虫的研究在空间上极为有限，且多集中于人类关联环境，对高北极地区微孢子虫群落多样性及其沿环境梯度的空间结构了解甚少。已有研究仅在斯瓦尔巴群岛的北极狐和家犬中检出过Ent. bieneusi和Enc. cuniculi的DNA，但缺乏对更广泛宿主和更大空间范围的系统调查。

基于此，研究人员提出假设：高北极地区微孢子虫的检出模式和群落组成受到人为压力（包括旅游干扰、家犬饲养和邮轮活动）与候鸟季节性存在共同塑造，叠加在本地北极宿主群落之上。受人类影响的区域可能成为微孢子虫引入、局部积累和再分布的焦点。为验证该假设，研究人员对来自斯瓦尔巴群岛五个岛屿九个地点的1467份粪便样本进行了宏条形码（metabarcoding）分析。

二、研究设计与技术方法

研究人员于2024年8月至9月开展为期两周的野外考察，在斯瓦尔巴群岛五个岛屿的九个地点非侵入性采集了白颊黑雁（Branta leucopsis，n=521）、斯瓦尔巴驯鹿（n=473）和北极狐（n=473）的粪便样本。其中324份样本来自受人类影响的定居点（朗伊尔城和尼奥勒松），1143份来自无人居住的偏远区域。样本在野外初步依据粪便形态鉴定宿主物种，随后通过细胞色素c氧化酶I基因（COI）片段测序进行分子确认。

分子分析采用改良的氢氧化铵法提取总基因组DNA，使用微孢子虫特异性引物对（CM-V5F/CM-V5R）扩增小亚基核糖体RNA基因（SSU rRNA）的高变V5区域，通过Ion Torrent S5系统进行下一代测序（NGS）。测序数据经质量过滤、去噪生成扩增子序列变体（ASVs），使用UNCROSS2算法去除阴性对照中的污染ASV，并以100%序列一致性阈值进行物种注释。对检出人兽共患微孢子虫的样本，进一步通过Sanger测序扩增约500 bp的SSU rRNA片段（覆盖V1-V3区域）进行验证。系统发育分析使用80条代表性参考序列，通过最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）构建系统发育树。统计分析采用Fisher精确检验、Shannon多样性指数、Mann–Whitney U检验、PERMANOVA和PERMDISP等方法。

三、主要研究结果

3.1 NGS数据概况

V5数据集共产生73,159,684条原始读段，质量过滤后保留68,793,855条，推断出115个ASV，其中10个归属于微孢子虫。所有粪便样本均成功获得COI扩增和测序结果，确认了宿主身份并表明DNA提取物适用于下游分子分析。

3.2 斯瓦尔巴群岛的微孢子虫

共158份样本（10.77%）检出微孢子虫DNA。检出率最高的区域为朗伊尔城地区（17.79%）和尼奥勒松（15.52%），最低为北部斯匹次卑尔根（2.97%）和东北地岛（3.42%）。检出的10个微孢子虫ASV归属于三个主要类群：Enterocytozoonida（6个）、Nosematida（2个）和Amblyosporida（2个）。其中三个ASV与Ent. bieneusi、Enc. cuniculi和Enc. hellem的参考序列具有100%一致性，其余七个ASV与所有参考序列的一致性低于100%，被视为潜在的新物种。Shannon多样性指数在朗伊尔城地区最高（H′=1.83），在东北地岛和北部斯匹次卑尔根最低（H′=0.56）。不同采样区域间的微孢子虫群落组成差异未达到统计学显著水平，但区域内的群落变异性存在显著差异。

3.3 各野生动物宿主中微孢子虫的出现情况

微孢子虫DNA在三种宿主中的检出率相近：白颊黑雁10.17%、北极狐10.78%、斯瓦尔巴驯鹿11.42%。最常见的非人兽共患微孢子虫为Uncultured Mrazekiidae sp. SV01、SV04和Uncultured Orthosomella-like sp. SV02、SV03，合计占阳性样本的70%以上。人兽共患微孢子虫的检出率以白颊黑雁最高（1.92%），北极狐次之（1.69%），斯瓦尔巴驯鹿最低（0.85%）。三种人兽共患物种均在北极狐和斯瓦尔巴驯鹿中检出，而白颊黑雁仅检出Ent. bieneusi和Enc. hellem。

3.4 人兽共患微孢子虫的空间格局

共22份样本（1.5%）检出人兽共患微孢子虫DNA，其中8份经Sanger测序确认。受人类影响区域的检出率（4.01%）显著高于自然区域（0.79%）。朗伊尔城地区检出率最高（4.33%），尼奥勒松为3.45%。在自然区域中，熊岛（Barents?ya）检出率为0.96%，奥托岛（Von Otter?ya）为1.85%，东北地岛和北部斯匹次卑尔根未检出。Ent. bieneusi在七个地点检出，检出率最高在朗伊尔城地区（3.85%）；Enc. cuniculi和Enc. hellem几乎仅在受人类活动影响的区域检出。层级聚类分析显示人兽共患微孢子虫群落存在显著空间结构，受人类影响区域与自然区域明显分离。多变量分析表明，三种人兽共患物种对第二轴的变异贡献最大，并与受人类影响的位点相关联；而Uncultured Gurleyidae sp. SV06和SV07则更多出现在偏远自然区域。

四、讨论与结论

研究人员指出，检出的非人兽共患微孢子虫主要隶属于与水生无脊椎动物宿主相关的科（Mrazekiidae、Gurleyidae、Orthosomella-like群），其在粪便中的检出可能反映环境暴露或偶然摄入孢子，而非活跃感染。三种人兽共患微孢子虫中，Enc. hellem在斯瓦尔巴群岛野生动物中的检出为首次记录。受人类影响区域人兽共患微孢子虫检出率显著更高，提示人为环境可能有利于微孢子虫孢子的局部循环。候鸟（尤其是白颊黑雁和粉足雁Anser brachyrhynchus）在低纬度越冬后迁徙至斯瓦尔巴群岛繁殖，可能通过大量粪便沉积将微孢子虫孢子引入北极生态系统。此外，雪橇犬饲养、旅游业活动和永久冻土融化（permafrost thaw）可能释放休眠生物体，均为潜在的微孢子虫引入和传播途径。研究人员强调，由于粪便宏条形码无法区分活跃感染与被动孢子摄入，且候鸟聚集与人类定居点可能重叠，当前数据无法完全区分候鸟、人为活动和环境因素的相对贡献。

研究结论指出，该研究首次对斯瓦尔巴群岛的微孢子虫多样性和出现情况进行了全面评估，鉴定出10个微孢子虫ASV，其中三个与公认的人兽共患物种匹配。受人类影响区域的人兽共患微孢子虫DNA检出率高于偏远自然区域。候鸟可能促进微孢子虫孢子在高北极的环境扩散，但人为活动（如旅游和雪橇犬饲养）的贡献无法排除。气候变化驱动的环境变化可能进一步影响微孢子虫孢子的环境出现和循环。这些发现表明，即使是偏远的极地生态系统也可能受到人为和环境过程相互作用的影响，包括候鸟介导的微孢子虫孢子长距离扩散，持续的气候变化可能进一步改变这些动态。在该快速变化的北极生态系统中，持续监测微孢子虫群落并采用互补的分子方法，对于理解其生态学、传播途径及潜在公共卫生意义至关重要。