《Environmental DNA》：Downstream Transport and Persistence of Amphibian Environmental DNA and RNA in Small Streams: Insights From a Caged Mudpuppy Experiment
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环境DNA（eDNA）越来越多地被用于两栖动物监测。然而，在小源头溪流中，从eDNA信号推断局部存在性的努力可能因下游传输、短期浓度波动以及与河床的相互作用而受到损害。环境RNA（eRNA）降解更快，可能提高空间和时间分辨率，但其在自然溪流中的命运仍然未知。研
环境DNA（eDNA）越来越多地被用于两栖动物监测。然而，在小源头溪流中，从eDNA信号推断局部存在性的努力可能因下游传输、短期浓度波动以及与河床的相互作用而受到损害。环境RNA（eRNA）降解更快，可能提高空间和时间分辨率，但其在自然溪流中的命运仍然未知。研究人员在三条水文和栖息地特征相似的小型源头溪流中进行了一项为期四天的笼养实验。研究人员使用了泥小狗（Necturus maculosus），该物种在研究地点不存在，以确保没有历史eDNA或eRNA污染读数。研究人员每天在距笼子最远1 km的多个下游站点采集三份横向样品。研究人员量化了eDNA和eRNA（环境核酸；eNA），模拟了eDNA传输，评估了时间动态，并预测了最大下游检测距离。eDNA检测表现出显著的横向异质性，但未观察到一致的模式。正如预期，eDNA信号随距笼子距离的增加而下降，但其基础基线水平和下游衰减速率在不同溪流和不同天数之间存在显著差异。模型预测表明，最大潜在检测距离范围从<1 km到约6 km不等，具体取决于溪流和天数。在移除笼子后长达16小时，残留eDNA仍可检测到，尽管水平降低。相反，eRNA显示出有限的下游传输（≤300 m）、无移除后持久性以及低检出率。研究人员的发现表明，尽管水文和栖息地特征相似，小型溪流中的eDNA水平在不同系统间可能存在显著差异，这强调了进行特定地点解释的必要性。eRNA提供了更高的空间和时间特异性，但其检测不一致。这些结果提高了研究人员对源头溪流中eNA动态的理解，并支持完善基于eNA的两栖动物溪流监测方法。
研究背景与科学问题
两栖动物是全球受威胁最严重的脊椎动物类群，约41%的物种面临灭绝风险。许多两栖动物与特定的水文和微生境条件紧密相关，其种群变化可作为栖息地质量和生态系统完整性的指示指标。传统的调查方法如视觉遇见调查、听觉调查、幼虫抄网捕捞和标记重捕等，虽然被广泛使用，但通常需要大量的野外工作和分类学专业知识，尤其对于幼体阶段，且可能对目标物种及其栖息地造成侵入性影响。
过去十年中，环境DNA（eDNA）已成为两栖动物监测的有力工具。通过直接从水样中检测物种特异性遗传物质，提供了一种灵敏、非侵入性且省时的替代方案。小型源头溪流（宽度<2 m）是许多溪流栖居两栖动物的关键繁殖、摄食和庇护栖息地，特别适合基于eDNA的监测。然而，在流动水体中解释eDNA数据颇具挑战，因为eDNA会被向下游传输，导致检测到的信号可能反映上游输入而非局部存在。eDNA在河流系统中的命运受下游传输、稀释、降解、向河床沉积以及再悬浮等多种过程的影响。已有研究表明，eDNA浓度随距源头的距离呈指数下降，流量是传输距离的关键预测因子。在低流量（≤1 m3 s?1）的小型溪流中，eDNA降解似乎次要，而沉积和在河床内的滞留被认为是eDNA从水柱中去除的主要驱动力。
尽管如此，关于eDNA在小源头溪流中时空动态的知识仍存在重要空白，限制了eDNA信号在溪流栖居两栖动物监测中的解读。首先，先前基于笼子的实验虽证明了eDNA浓度的横向异质性，但这些研究多在较大河流中进行，小型溪流中的横向变异性尚不清楚。其次，流动水体环境中eDNA释放和下游传输的短期时间动态了解甚少，例如在生物体连续存在的数天内，eDNA浓度和衰减模式如何演变。第三，很少有实证研究考察生物体移除后eDNA在自然河流环境中能持续多久。此外，环境RNA（eRNA）因其较低的环境持久性而被认为是一种有前景的生物标志物，可能提供更精细的空间和时间分辨率。然而，目前对脊椎动物eRNA的野外研究大多集中在利用宏条形码比较群落组成，对eRNA在流动水体中命运的了解非常有限。
针对上述问题，本研究在三条水文和栖息地特征相似的小型源头溪流中，使用当地不存在的泥小狗（Necturus maculosus）作为目标物种，通过为期四天的笼养实验，旨在：（1）量化eDNA信号的横向变异程度；（2）描述生物体存在最初几天内eDNA基线水平和下游衰减的短期时间变化；（3）评估生物体移除后eDNA的持久性；（4）评估eRNA的可检测性、下游传输和持久性，以确定其相对于eDNA是否能提供额外的空间或时间分辨率。
主要技术方法
- 1.
野外采样与实验设计：于2023年9月在加拿大魁北克省斯托克山的三条一级溪流（溪流A、B、C）中进行。每条溪流放置四个装有七只泥小狗的软聚酯洗衣袋笼子（50×60 cm，3 mm孔径）。在笼子上游1 m至下游1000 m范围内设置13个采样站，每日在每个站的左、中、右三个横向位置各采集2 L水样，共持续三天。第三天结束时移除笼子，第四天（16小时后）在1 m和200 m站再次采样。共收集369个水样。所有泥小狗来自渥太华河。
- 2.
eDNA与eRNA提取与定量：使用ZR-Duet DNA/RNA MiniPrep Kit Plus从整张滤膜中共提取DNA和RNA。RNA经逆转录为互补DNA（cDNA）。采用针对泥小狗线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因的物种特异性TaqMan qPCR检测体系（NEMA）进行定量。每个样品运行六个技术重复，并设置SPUD内部阳性对照以检测抑制物。
- 3.
数据分析：采用线性模型评估下游距离、溪流身份和采样日对eDNA通量的影响，并通过AICc选择最优模型。使用逆距离加权法（IDW）插值可视化eDNA/eRNA空间分布。基于模型预测最大下游检测距离。
研究结果
3.1 栖息地特征
三条溪流的河岸冠层均以糖枫为主，河床底质组成相似。平均流量无显著差异，但溪流B的水深纵向变异系数显著高于溪流A和C，表现为明显的浅滩-深潭序列。
3.2 检测体系性能与质量控制
NEMA qPCR检测体系对泥小狗具有高度特异性，灵敏度高（检测限LOD = 0.8拷贝/反应，定量限LOQ = 3拷贝/反应），效率达91%。所有阴性对照均无扩增，SPUD检测证实无PCR抑制。
3.3 eDNA
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3.3.1 横向位置效应：eDNA通量在同一站点的三个横向位置间表现出显著变异性（中位范围为1.29 log??单位），约三分之一的站点存在不完全横向检测。但统计分析未发现任何溪流或采样日中横向位置间的系统性差异，弯道内外侧也无显著差异。
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3.3.2 下游距离与环境效应：最优线性模型解释了81%的eDNA通量变异，包含距离、溪流、采样日及其交互项，以及水深作为协变量。eDNA通量随下游距离增加而下降，但衰减斜率在不同溪流和采样日间存在显著差异。溪流B的衰减斜率显著陡于溪流A和C。基线eDNA水平在溪流间也存在显著差异，溪流C最高。在溪流B中，基线水平从第1天到第3天显著下降；而在溪流B和C中，第1天的衰减斜率比第3天更陡。模型预测的最大下游检测距离在溪流A约为1-2 km，溪流B小于1 km，而溪流C在第3天可达约6 km。
3.4 eRNA
在369个eRNA样品中，仅有19个呈阳性。eRNA的最大下游检测距离为300 m（溪流A和B）或50 m（溪流C）。第四天（笼子移除16小时后）在所有溪流中均未检测到eRNA。在eRNA阳性样品中，eDNA与eRNA通量之间无显著相关性。
讨论与结论
本研究首次尝试在自然溪流中表征eRNA的传输过程。研究发现，eDNA在小溪流中存在显著的横向异质性，这种异质性源于狭窄河道中微小尺度的水力复杂性，因此不能将大河中的横向模式直接外推至小溪流。尽管三条溪流水文和栖息地特征相似，但eDNA的基线水平和下游衰减模式存在显著差异，这表明系统特异性解释至关重要。溪流B因具有更明显的浅滩-深潭结构，增强了水流与河床的接触，可能导致更快的eDNA沉积和更陡的衰减斜率。eDNA在生物体移除后16小时仍可检测到，这可能反映了短暂存储后的延迟释放或河床沉积物的再悬浮。
相比之下，eRNA仅能在距源很近的距离（≤300 m）内检测到，且在生物体移除后完全消失，这表明eRNA一旦被检测到，其来源生物很可能就在附近且当前存在，提供了更高的空间和时间特异性。然而，eRNA的总检出率极低，这可能归因于有限的脱落率、较短的停留时间、快速降解以及稀释作用。研究还发现eDNA与eRNA通量之间无显著相关性，这与两者比率受多种因素影响的观点一致。
研究结论：本研究揭示了基于eNA的方法在监测溪流栖居两栖动物方面的潜力，并对小型溪流eNA调查的设计提出了几点启示。首先，强烈的横向变异性表明单点采样可能增加漏检风险，因此采样设计应考虑横向整合或在站点内设置重复样。其次，即使在水文和栖息地特征相似的溪流间，eDNA的基线水平和衰减模式也存在显著差异，最大检测距离可能相差很大，这强调了对系统特异性解读的需求。第三，生物体移除后eDNA仍可持续存在数小时，这意味着在进行近期存在与否的管理决策时，弱阳性信号需谨慎解读。eRNA可能提供更高的空间和时间特异性，但在确认其实用价值之前，仍需进一步研究其在河流环境中的命运和可检测性。本研究的结果提高了对源头溪流中eNA动态的理解，并为随着该领域发展而不断完善基于eNA的监测方法奠定了基础。
