《European Journal of Immunology》：Discovery of Avian TCRVβ2+ T Cells Recognizing the Endogenous Ganglioside via a chCD1.1-Dependent Pathway
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本研究首次报道了鸡脂质反应性自然杀伤T（NKT）样细胞的发现及其功能性表征，填补了禽类免疫学领域长期存在的知识空白。研究人员利用纯化的TCRVβ2+淋巴细胞，通过结合shRNA介导的基因沉默、药理学通路阻断、原代磁珠分选（MACS）共培养以及细胞内细胞因子流式
本研究首次报道了鸡脂质反应性自然杀伤T（NKT）样细胞的发现及其功能性表征，填补了禽类免疫学领域长期存在的知识空白。研究人员利用纯化的TCRVβ2+淋巴细胞，通过结合shRNA介导的基因沉默、药理学通路阻断、原代磁珠分选（MACS）共培养以及细胞内细胞因子流式细胞术等严谨实验，证明这些细胞可被CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）刺激的抗原呈递细胞（APC）激活。该激活选择性地依赖于APC驱动的糖鞘脂（GSL）生物合成，CpG-ODN显著上调APC中关键生物合成酶ST3GAL1和ST3GAL5的表达。沉默该通路中的相关酶或化学抑制GSL合成均可消除T细胞的活化。研究人员鉴定出GM3是一种有效的功能性脂质配体，可激活TCRVβ2+淋巴细胞。与此同时，白细胞介素-12（IL-12）和白细胞介素-18（IL-18）可触发TCRVβ2+淋巴细胞产生干扰素-γ（IFN-γ），这一过程严格依赖于活APC的相互作用。用GM3刺激脾细胞后，细胞表达了鸡IL-2（chIL-2）、鸡IL-4（chIL-4）、鸡IL-17（chIL-17）、颗粒酶A（Granzyme A）和穿孔素（Perforin）。通过在鸡体内建立功能性非肽脂质反应性T细胞，这些发现重新定义了禽类先天性样T细胞免疫学的概念框架。该发现为开发基于脂质佐剂的禽用疫苗提供了一个高度可转化且通用的靶点，有助于提升全球动物健康和食品安全水平。
研究背景与科学问题
在哺乳动物中，自然杀伤T（NKT）细胞是一类先天性样T淋巴细胞，能够识别由CD1分子呈递的脂质和糖脂抗原，在连接先天性与适应性免疫中发挥关键作用，参与抗肿瘤和抗病原体免疫应答。这类细胞通常表达半恒定的T细胞受体（TCR），受限于CD1d分子，激活后可快速分泌多种免疫调节细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）、IL-13和IL-17A等，并通过促进树突状细胞成熟来增强抗原特异性T、B细胞应答。基于这些特性，NKT细胞配体已被用作疫苗佐剂以提高免疫原性。然而，尽管在鸡中已鉴定出哺乳动物CD1d的结构同源物（chCD1.1和chCD1.2）且证实其具备脂质结合沟槽，但关于CD1限制性、脂质反应性T细胞的功能性证据一直缺乏。鉴于疫苗接种在控制禽类传染病中的重要性，鉴定并表征鸡体内的NKT样细胞对于改进疫苗策略具有重要意义。鸡T细胞根据TCRαβ表达分为两大亚群：TCR2（TCRVβ1+）和TCR3（TCRVβ2+），二者表型特征和组织分布已有描述，但其功能特化，特别是与先天性样或NKT样活性相关的功能，仍不清楚。因此，本研究的目的是探索鸡体内是否存在功能性脂质反应性T细胞亚群及其作用机制。
研究方法概述
本研究的主要关键技术方法包括：（1）从3周龄特定无病原体（SPF）罗德岛红鸡的脾脏和股骨中分离细胞；（2）使用磁珠分选（MACS）技术纯化鸡CD3+、TCRVβ1+和TCRVβ2+ T细胞，纯度经流式细胞术确认超过97%；（3）利用重组鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-4诱导骨髓来源树突状细胞（BMDC），或用鸡巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导骨髓来源巨噬细胞（BMM）作为抗原呈递细胞（APC）；（4）采用IFN-γ酶联免疫斑点（ELISpot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）定量检测IFN-γ的产生；（5）使用短发夹RNA（shRNA）介导的基因沉默敲低目标基因，并通过实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）验证敲低效率；（6）应用药理学抑制剂如DL-threo-1-phenyl-2-palmitoylamino-3-morpholino-1-propanol（PPMP）和N-(n-butyl)deoxygalactonojirimycin（NB-DGJ）阻断糖鞘脂（GSL）生物合成；（7）通过细胞内细胞因子染色结合流式细胞术确定IFN-γ产生的细胞来源。
研究结果
3.1 CpG-ODN处理的BMDC或BMM激活鸡CD3+TCRVβ2+ T细胞产生IFN-γ
研究人员首先发现，CpG-ODN刺激鸡脾细胞可显著增加IFN-γ的产生。纯化的CD3+、TCRVβ1+或TCRVβ2+ T细胞在单独接受CpG-ODN刺激时不产生IFN-γ，表明需要APC的参与。将CpG-ODN预处理的BMM或BMDC与T细胞共培养后发现，活化的APC选择性诱导TCRVβ2+ T细胞而非TCRVβ1+ T细胞产生IFN-γ。固定后的APC无法诱导此反应，证明活APC是激活所必需的。
3.2 CD3+TCRVβ2+ T细胞的激活与CpG-ODN处理APC中GSL生物合成的增加相关
CpG-ODN刺激BMDC后，GM3合酶（ST3GAL5）和ST3GAL1的mRNA表达显著上调，表明GSL通路被激活。使用GSL合成抑制剂PPMP或NB-DGJ预处理BMDC可将IFN-γ产生细胞减少约50%至60%。通过shRNA分别沉默UGCG和ST3GAL5基因后，CpG-ODN诱导的IFN-γ产生也显著降低。这些结果表明TCRVβ2+ T细胞的激活依赖于APC驱动的GSL生物合成。
3.3 CD1.1参与向CD3+TCRVβ2+ T细胞呈递脂质配体
CpG-ODN刺激BMDC后，chCD1.1 mRNA在10小时显著上调约四倍，而chCD1.2表达不变。通过shRNA沉默chCD1.1后，CpG-ODN诱导的IFN-γ产生显著下降，表明chCD1.1是TCRVβ2+ T细胞最佳激活所需的脂质抗原呈递分子。
3.4 CD3+TCRVβ2+ T细胞识别神经节苷脂GM3并产生NKT相关细胞因子
在总脾细胞中，外源性GM3（而非GM1）可诱导IFN-γ产生。将GM3脉冲的BMDC与不同T细胞亚群共培养发现，仅CD3+TCRVβ2+ T细胞产生IFN-γ。GM3刺激脾细胞后，chIL-2、chIL-4、chIL-17、颗粒酶A（GZMA）和穿孔素（PFA1）的mRNA表达均显著上调。细胞内IFN-γ染色进一步确认，GM3刺激后IFN-γ仅来源于TCRVβ2+ T细胞而非TCRVβ1+ T细胞。
3.5 重组IL-12和IL-18在APC存在下诱导CD3+TCRVβ2+ T细胞产生IFN-γ
CpG-ODN刺激BMDC后，chIFN-α、chIFN-β、chIL-12和chIL-18的mRNA均显著上调。只有重组chIL-12和chIL-18能在脾细胞中诱导IFN-γ产生，而chIFN-α和chIFN-β效果甚微。在共培养体系中，chIL-12和chIL-18选择性诱导TCRVβ2+ T细胞产生IFN-γ，且必须依赖活BMDC的存在，固定后的APC即使加入细胞因子也无法支持此反应。
讨论与结论
本研究提供了首个功能性证据，证明鸡体内存在一类特化的先天性样T细胞群体，其特性类似于哺乳动物的恒定自然杀伤T（iNKT）细胞。研究表明，CpG-ODN活化的APC通过脂质依赖性和细胞因子介导两条途径共同刺激鸡TCRVβ2+ T细胞，确立了这些细胞在禽类免疫系统中的保守角色。核心发现是鸡T细胞激活需要APC对内源性脂质的代谢加工，CpG-ODN上调关键生物合成酶UGCG和ST3GAL5，化学抑制或基因沉默该通路均显著削弱APC激活TCRVβ2+ T细胞的能力。神经节苷脂GM3被鉴定为有效的外源性配体，GM3脉冲的BMDC特异性激活TCRVβ2+亚群。数据表明chCD1.1参与了这些NKT样细胞的激活，但并非唯一依赖途径。此外，鸡NKT样细胞似乎遵循“双信号”需求模式：chCD1.1-脂质复合物提供初级TCR信号，同时CpG-ODN诱导APC分泌IL-12和IL-18，但这些细胞因子在无活APC存在时无法驱动T细胞反应，提示仍需膜结合组分或基线水平的脂质呈递使细胞获得对细胞因子的响应能力。GM3刺激的脾细胞不仅产生IFN-γ，还表达chIL-2、chIL-4、chIL-17以及颗粒酶A和穿孔素等细胞毒性标志物，这种多功能能力使其能够桥接禽类的先天性和适应性免疫。
研究结论：本研究鉴定了一群以APC依赖性方式识别内源性和外源性神经节苷脂的TCRVβ2+ T细胞群体。这些发现拓展了对禽类免疫学的理解，并为开发用于家禽疫苗的脂质基佐剂提供了潜在靶点，以增强对病毒和细菌病原体的保护力。由于chCD1.1相较于经典鸡主要组织相容性复合体（MHC）分子高度保守且非多态性，基于脂质佐剂的疫苗配方可为遗传多样性的散养鸡群提供一种通用、不依赖宿主基因型的平台，有望减少家禽业对预防性抗生素的依赖，提高生产效率、食品安全和整体禽群福利。
