纯合GABRA2 p.A407K变异通过改变α2亚基GABAA受体门控与婴儿痉挛症进展至Lennox-Gastaut综合征相关

《Neurobiology of Disease》：A homozygous GABRA2 variant associated with infantile spasms evolving to Lennox-Gastaut syndrome alters receptor gating

　　

发育性癫痫性脑病（developmental and epileptic encephalopathy，DEE）是严重的儿童期起病神经系统疾病，以早期癫痫发作、发育迟缓及持续性网络过度兴奋为特征。遗传学研究已证实抑制性γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）信号通路的功能受损是此类疾病的重要致病机制。研究人员在一例婴儿痉挛症（infantile epileptic spasms syndrome，IESS）进展为Lennox-Gastaut综合征（LGS）的患者中鉴定出一种纯合GABRA2 c.1219_1220delGCinsAA（p.A407K）变异。该变异位于编码α2亚基的胞内TM3-TM4环内，此区域在癫痫相关GABAA受体变异中研究极为有限。为明确p.A407K的致病机制，研究人员利用异源表达系统与CRISPR/Cas9敲入小鼠模型进行了系统研究。结果显示，p.A407K使α2β3γ2受体的脱敏过程显著减慢，但未影响受体向细胞表面的转运；表达突变受体的人胚肾293T细胞（HEK293T）内氯离子浓度较野生型升高。在携带同源Gabra2 p.A407K纯合突变的成年小鼠中，海马CA1锥体神经元静息膜电位去极化，距动作电位阈值的距离缩短；在6 Hz角膜刺激癫痫模型中，突变小鼠癫痫发作持续时间显著延长；行为学分析显示突变小鼠自发运动活性和探索行为增加。上述结果表明，p.A407K通过改变受体门控特性而非破坏受体表达来发挥致病作用，该敲入小鼠模型能够复现部分选择性电生理和癫痫相关特征，但未表现出患者严重的发育表型。本研究为GABRA2胞内环区变异在DEE发病机制中的贡献提供了直接实验证据，并建立了一种可用于后续机制研究的体内模型。

**论文解读：纯合GABRA2 p.A407K变异改变GABAA受体门控并介导婴儿痉挛症向Lennox-Gastaut综合征演变的机制研究**

发育性癫痫性脑病（DEE）是以早期癫痫发作、发育迟缓及持续性脑网络过度兴奋为特征的严重儿童期疾病。遗传学证据表明，抑制性γ-氨基丁酸（GABA）信号受损是DEE的核心致病机制之一，编码GABAA受体各亚基的基因（如GABRA1、GABRB2、GABRB3、GABRG2）变异已被反复关联至婴儿痉挛症综合征（IESS）、Lennox-Gastaut综合征（LGS）及相关DEE。GABRA2编码α2亚基，新发变异已有报道与早发性癫痫脑病及DEE78型相关，但该基因变异相关的临床表型谱与致病机制尚未完全阐明，尤其GABRA2变异与IESS向LGS进展这一临床轨迹的直接关联在此前鲜有记录。此外，大多数已功能表征的癫痫相关GABAA受体变异位于胞外配体结合域或跨膜区，而位于胞内TM3-TM4环的变异，因其涉及受体调制与细胞内相互作用，功能意义尚不明确。本研究即在患者中鉴定出位于该区域内的一种纯合GABRA2 c.1219_1220delGCinsAA（p.A407K）变异，并利用异源表达系统和基因敲入小鼠模型系统解析该变异在受体门控、神经元兴奋性、癫痫易感性和行为层面的功能后果，以评估其致病性并构建对应的体内疾病模型。

研究人员在该研究中使用了多项关键技术。遗传学方面，研究对先证者及其父母进行了全外显子组测序（WES），测序由GeneDX?完成，数据比对至人类参考基因组GRCh38，并通过gnomAD与ClinVar数据库进行变异注释。功能研究方面，研究人员构建了人源与鼠源GABRA2/Gabra2 p.A407K突变体，利用爪蟾卵母细胞双电极电压钳及HEK293T细胞全细胞膜片钳技术记录受体电流，以评估脱敏动力学与激动剂敏感性；同时采用非透化免疫荧光标记检测受体表面表达，并用比色法测定细胞内氯离子浓度。体内研究方面，研究人员采用CRISPR/Cas9技术生成携带同源Gabra2 p.A407K突变的C57BL/6J纯合敲入小鼠，该品系回交至少10代，共使用337只小鼠（野生型171只，纯合突变166只）。行为学与电生理检测包括6 Hz角膜刺激癫痫模型、海马内脑电图（EEG）记录、旷场实验、转轮跑动、高架十字迷宫、Barnes迷宫、新颖物体识别等，并在急性海马脑片上对CA1锥体神经元进行了全细胞电流钳记录。

研究结果分为八个部分。一、在IESS进展至LGS患者中鉴定出GABRA2变异：全外显子组测序在患者中检出纯合c.1219_1220delGCinsAA（p.A407K）变异，双亲均为杂合携带者，符合常染色体隐性遗传；该变异在gnomAD中不存在，且第407位丙氨酸跨物种高度保守，但ClinVar分类存在冲突，单独依据遗传与数据库证据尚不足确定致病性。二、GABRA2 p.A407K减慢受体脱敏：免疫荧光显示突变受体表面表达不受影响；在爪蟾卵母细胞及HEK293T细胞中，人源与鼠源α2p.A407Kβ3γ2受体在通道开放后固定时间点的恢复百分比均显著低于野生型，表明脱敏减慢；EC50无显著改变；表达突变受体的HEK293T细胞内氯离子水平较野生型升高，提示突变可能降低抑制性驱动力。三、Gabra2p.A407K/A407K敲入小鼠的生成与基线特征：纯合小鼠可存活，出生基因型比例符合孟德尔定律；突变小鼠成年体重显著低于野生型，胃肠转运时间显著延长，而粪便排出量、摄食饮水及糖精偏好无基因型差异。四、突变CA1锥体神经元距动作电位阈值更近：脑片记录显示突变神经元静息膜电位显著去极化（-70.9 ± 4.8 mV对-73.5 ± 3.9 mV），阈值距离（静息电位与动作电位阈值之差）显著缩短，但阈电位、峰幅度、半宽及放电频率无显著差异。五、成年EEG检测未发现自发性癫痫活动：在4只野生型与3只纯合突变小鼠的连续海马内EEG记录中，未检测到自发癫痫发作或明显痫样放电，但因样本量小，不能排除偶发或发育期限制性异常。六、成年突变小鼠在6 Hz角膜刺激模型中癫痫持续时间延长：所有小鼠均诱发出精神运动性癫痫，突变小鼠癫痫持续时间显著长于野生型（75.2 ± 71.7 s对46.0 ± 41.0 s），Racine评分呈增高趋势但未达显著性。七、成年突变小鼠运动活性增加：旷场实验中突变小鼠总移动距离显著增加，转轮跑动转数显著升高；高架十字迷宫中总移动距离、平均速度及臂进入次数均显著增加，但开放臂停留时间无基因型差异，表明运动驱动增强而非焦虑样行为改变。八、认知实验受探索活性增加影响：Barnes迷宫中突变小鼠总错误数更少、进入逃逸箱所需时间更短，但差异在训练首日即已出现，且突变小鼠在迷宫中移动速度显著更快，提示结果主要反映运动活性差异而非空间学习能力增强；新颖物体识别实验中，24小时辨别指数无基因型差异，不提示识别记忆损伤。

讨论部分指出，p.A407K位于GABAA受体胞内TM3-TM4环，该区域变异此前功能研究极为有限，本研究首次证明该区域内变异可通过改变受体脱敏而非影响表面表达来发挥效应。受体脱敏减慢的生理后果取决于神经元背景：在氯离子平衡电位高度超极化的条件下，脱敏减慢可能延长抑制；但在持续或重复激活时，延长的氯离子电导可能促进胞内氯离子积聚，使氯离子反转电位去极化并降低抑制性驱动力，从而促进网络过度兴奋。突变受体表达细胞中升高的胞内氯离子支持这一假说，但该测量在缺乏成熟神经元氯离子调节机制的HEK293T细胞中完成，需谨慎解读。CA1神经元静息膜电位去极化且距离阈值更近，提示在静息状态下突变神经元更接近放电阈值，但阈电位和放电频率无变化，不能据此认定普遍的内在兴奋性增高。6 Hz刺激后癫痫持续时间的延长与边缘环路网络层面癫痫动态改变一致。行为学层面，突变小鼠的主要表型是运动与探索活动增加，高架十字迷宫开放臂时间无差异排除焦虑样表型；Barnes迷宫和新颖物体识别的组间差异均可归因于运动活性增加，不构成学习记忆增强的证据，也未复现患者严重的发育损伤。值得指出的是，患者使用对α2亚基相对有优先亲和力的苯二氮?类药物氯巴占时出现癫痫加重而停药，这一临床观察虽具有提示性，但尚不能确立机制关联。研究人员强调该敲入小鼠应被视为“变异机制模型”而非IESS/LGS/DEE的完整疾病模型，其价值在于证明p.A407K并非功能沉默变异，能够在体内改变受体门控、神经元膜特性、诱发癫痫动态及行为。该模型未复现患者严重发育表型，可能与物种差异、补偿机制、小鼠遗传背景（C57BL/6J背景本身携带降低α2表达的天然亚效剪接变异）及发育阶段差异有关。本研究的局限性包括：神经元生理检测仅限于成年CA1锥体神经元，未覆盖抑制性中间神经元及其他癫痫相关神经元类群；胞内氯离子数据来源于异源细胞；EEG队列较小；且患者的临床表型出现在婴儿早期，而多数小鼠实验在成年期完成。研究结论为：位于GABRA2 TM3-TM4环内的罕见纯合变异p.A407K在不影响受体转运的情况下改变受体门控，并在敲入小鼠中产生可测量的神经元与行为效应；在有限的成年EEG队列中未检测到自发癫痫发作或明显痫样活动，但成年Gabra2p.A407K/A407K小鼠在6 Hz角膜刺激后癫痫持续时间显著延长；上述发现支持p.A407K的有害效应，同时提示该敲入模型捕获的是选择性的变异相关表型而非人类DEE的完整表型。