母体递送 MuSK 激动剂抗体：一种通过靶向神经肌肉突触形成以理解和治疗早发性神经肌肉疾病的新策略，并揭示 Agrin 的 MuSK 非依赖性突触维持作用

《Neurobiology of Disease》：Maternal delivery of a MuSK agonist antibody reveals a novel strategy for understanding and treating early-onset neuromuscular diseases

母体递送 MuSK 激动剂抗体 (MuSK agonist antibody) 可防止 Dok7^CM 后代致死。该抗体通过卵黄囊/胎盘 (yolk sac/placenta) 转移至后代。通过激活 MuSK 对神经元 agrin (neuronal agrin) 突变小鼠的新生期挽救未能持续。Agrin 在形成突触中具有超出激活 MuSK 的作用。该治疗策略应推进神经肌肉疾病 (neuromuscular diseases) 的治疗。

研究人员围绕先天性肌无力综合征 (congenital myasthenic syndrome, CM) 的小鼠模型，研究了母体递送 MuSK 激动剂抗体能否在产前挽救携带突变的子代，并据此探讨神经元 Agrin 是否具有独立于 MuSK 的功能。神经肌肉突触形成和维持依赖 Agrin、Lrp4、MuSK、Dok7 与 Rapsyn 五个关键基因。神经元 Agrin 结合肌肉 Lrp4，促进 Lrp4 与 MuSK 结合并激活 MuSK 激酶；活化 MuSK 招募 Dok7，帮助 MuSK 二聚化并稳定其磷酸化，进而通过转录与翻译后通路促进突触蛋白表达及乙酰胆碱受体 (acetylcholine receptors, AChRs) 锚定，Rapsyn 则直接结合 AChRs 并参与其聚集。上述基因突变可导致 CM，损害 AChR 表达、锚定及突触结构，造成突触传递障碍、肌无力和易疲劳；AChR 或 MuSK 自身抗体还可导致成年起病肌无力 (myasthenia gravis, MG)。既往研究显示，在混合遗传背景中，出生后第 4 天给予 MuSK 激动剂抗体可挽救 Dok7^CM 小鼠的早期致死及复发；但在近交 C57BL/6 背景中，Dok7^CM 小鼠出生即因致死性呼吸衰竭死亡，阻碍了治疗研究。因此，研究人员试图通过孕期给药绕过新生儿致死瓶颈，并检验神经元 Agrin 是否除激活 MuSK 外还具有维持突触的作用。

关键技术方法方面，研究人员使用 Dok7^CM 小鼠 (Dok7^{1124_1127 TGCC dup})，分别维持于 C57BL/6 或 CBA-C57BL/6 混合背景；神经元 agrin 和 rapsyn 突变小鼠来自 Dr. J. Sanes，维持于 C57BL/6 背景。孕鼠在胚胎期经腹腔注射 MuSK 激动剂抗体 ARGX-119 或其衍生物 3B2，对照为 mota。研究观察子代出生后的孟德尔比例、体重、存活与疾病终点，并进行交叉寄养实验。组织学上取膈肌，以 Alexa 488-α-BGT 标记 AChR，以抗体标记 β-III Tubulin/Synapsin，经共聚焦成像和 ImageJ 定量突触数、突触大小、突触 AChR 密度及完全或部分失神经。所用抗体为 hIgG₁ 骨架并含 L234A/L235A 突变。上述关键方法约 250 字。

研究结果如下。

2.1 母体递送 MuSK 激动剂抗体可挽救 Dok7 突变后代致死。研究人员将混合背景 Dok7 杂合小鼠互交，并在胚胎 E5.5 和 E15.5 给孕鼠注射 ARGX-119 (20 mg/kg) 或对照 mota (20 mg/kg)。子代本身未注射。结果，ARGX-119 母鼠所生 Dok7^CM 后代存活至少两个月，并增重 4 至 5 周；mota 组后代仅存活约两周。P60 时，被挽救 Dok7^CM 小鼠的突触数、突触大小和突触 AChR 密度分别为野生型水平的 67%、45% 和 40%。在近交 C57BL/6 背景中，mota 不能挽救新生期致死；ARGX-119 母鼠所生 Dok7^CM 后代按孟德尔比例产后回收，增重并存活至少两个月。P60 时突触数、突触大小和突触 AChR 密度分别为野生型水平的 46%、59% 和 48%，且未见部分或完全失神经。该结果表明，母体递送 ARGX-119 可在不同遗传背景中挽救 Dok7^CM 新生期致死，并部分恢复突触后分化。

2.2 MuSK 激动剂抗体经卵黄囊/胎盘而非母乳转移至后代。研究人员进行交叉寄养：将 mota 处理母鼠所生 Dok7^CM 后代交由孕期注射 ARGX-119 的养母哺乳；同时将 ARGX-119 处理母鼠所生后代交由 mota 处理养母哺乳。结果显示，ARGX-119 母鼠所生 10 只 Dok7^CM 后代均增重并存活至少两个月；而 mota 母鼠所生、由 ARGX-119 养母哺乳的 5 只 Dok7^CM 后代未能增重，并在出生后两周内达到疾病终点。该结果表明，出生后经乳汁暴露 ARGX-119 不足以挽救突变后代，产前经卵黄囊/胎盘暴露才是治疗挽救和长期存活所必需。

2.3 MuSK 激动剂抗体不能挽救 rapsyn 突变小鼠新生期呼吸衰竭。研究人员将 C57BL/6 背景 rapsyn 杂合小鼠互交，并在 E5.5 和 E15.5 给孕鼠注射 ARGX-119。rapsyn 突变后代未按孟德尔比例活产，仅一只出生后表现呼吸缺陷并存活约一小时。该结果表明，ARGX-119 不能挽救 rapsyn 突变小鼠，符合 Rapsyn 作用于 MuSK 下游的既有认识。

2.4 母体递送 MuSK 激动剂抗体可挽救神经元 agrin 突变后代新生期致死。研究人员将神经元 agrin 杂合小鼠互交，并在 E13.5 给孕鼠注射 3B2 (20 mg/kg)，即 ARGX-119 的衍生物。神经元 agrin 突变后代在 3B2 处理母鼠中按孟德尔比例产后回收；mota 处理母鼠所生神经元 agrin 突变后代未能活产。该结果表明，产前激活 MuSK 可补偿神经元 Agrin 缺失，支持 Agrin 在 MuSK 上游发挥作用。然而挽救不持续：被救小鼠出生后增重约一个月，随后增重减慢，超过半数在 P48 前达到疾病终点。当小鼠体重丢失 10% 时追加 3B2，未能逆转或减缓体重下降，所有 8 只小鼠均在两个月内达到疾病终点。该结果表明，3B2 水平不足并非衰退原因；与 Dok7^CM 的长期挽救及其复发可被 MuSK 激动剂抗体快速逆转不同，神经元 agrin 突变小鼠的挽救短暂且不能由追加 MuSK 激动剂逆转。

2.5 Agrin 在形成和维持神经肌肉突触中具有 MuSK 非依赖性作用。研究人员检查 P10 和 P40 神经元 agrin 突变小鼠膈肌。突触后分化被部分挽救，P40 时突触数、突触大小和突触 AChR 密度分别为正常水平的 48%、71% 和 42%。但失神经明显：AChR 丰富突触后膜未被神经末梢对置的区域从 P10 的 65% 增至 P40 的 78%；完全失神经的原有突触位点从 P10 的 12% 增至 P40 的 18%。相比之下，被挽救 Dok7^CM 小鼠未见失神经。该结果表明，尽管两类被救小鼠的突触后参数相似，神经元 agrin 突变小鼠仍出现显著部分或完全失神经，说明 Agrin 具有独立于 MuSK 的作用，参与维持神经末梢与肌肉的附着并防止失神经。

讨论部分，研究人员总结认为，母体递送 MuSK 激动剂抗体可挽救 Dok7 或神经元 agrin 突变后代的新生期致死，但不能挽救 rapsyn 缺失小鼠。该策略有助于研究更多 CM 小鼠模型，包括 Lrp4、agrin、MuSK 本身等作用于 MuSK 上游的基因突变，以及调控神经元 Agrin、Lrp4、MuSK 和 Dok7 表达与功能的基因；该策略应促进疾病机制研究与治疗开发，尤其针对人类围产期致死性 CM。母体使用 MuSK 激动剂抗体，包括 ARGX-119，也可能拓展至其他早发性神经肌肉疾病，如脊髓性肌萎缩 (spinal muscular atrophy, SMA)；MuSK 激动剂抗体已在 SMA 小鼠模型中改善支配并减少肌肉萎缩，并促成一项联合 ARGX-119 与 smn2 剪接调节剂的 2 期临床试验 SPARKLE (NCT07287982)。Dok7^CM 后代可存活至少两个月，而神经元 agrin 突变后代存活不足两个月并表现明显失神经，支持神经元 Agrin 除刺激 MuSK 外，在神经肌肉突触发育和维持中具有功能，尤其对维持神经末梢与肌肉附着、防止失神经至关重要。作者提出，神经元 Agrin 位于突触基底板，可结合并捕获经金属蛋白酶剪切释放的 Lrp4 胞外域 (ecto-Lrp4)，限制其在突触 cleft 内扩散，并将 Lrp4 呈递给运动神经元上的 Lrp4 受体，从而促进突触前分化；若神经元 Agrin 缺失，ecto-Lrp4 扩散离开，突触前分化受损，运动神经末梢逐渐脱离，导致失神经。作者还提出 Lrp4 不同结构域分别介导其与神经元 Agrin、MuSK 和运动神经元受体的结合，使神经元 Agrin 可能作为协调中枢整合 Lrp4 的多重功能。研究结论翻译如下：母体递送 MuSK 激动剂抗体可挽救 Dok7 突变后代的突触形成并防止新生期致死，使被挽救小鼠存活至少两个月。相反，尽管 MuSK 激动剂抗体使神经元 agrin 突变后代免于新生期致死，被挽救小鼠存活不足两个月并表现明显失神经。总之，这些发现支持神经元 Agrin 除刺激 MuSK 外，在神经肌肉突触发育和维持中具有功能，尤其对维持神经末梢与肌肉附着和防止失神经至关重要。