APOBEC1 缺失破坏 RNA 编辑稳态并加速朊病毒病进展

《Neuroscience Letters》：Loss of APOBEC1 disrupts RNA editing homeostasis and accelerates prion disease progression

摘要

背景

RNA编辑是一种表观转录组机制，能够塑造转录组多样性并精细调控神经元功能。虽然ADAR酶催化的腺苷酸到肌苷酸（A-to-I）编辑在神经退行性疾病中已被广泛研究，但APOBEC1催化的胞苷酸到尿苷酸（C-to-U）编辑的作用在很大程度上仍未被探索。

方法

我们利用互补的体外和体内模型，研究了APOBEC1对RNA编辑稳态和朊病毒疾病进展的影响。在非感染性N2A细胞和朊病毒感染性sc-N2A小鼠神经母细胞瘤细胞中，建立了全局RNA编辑和基因表达谱，条件为对照状态或APOBEC1耗竭状态。通过shRNA介导的敲低沉默APOBEC1，以评估其调控贡献。在Apobec1基因敲除小鼠中评估体内疾病进展，这些小鼠接受RML朊病毒感染，以评估生存结局。

结果

朊病毒感染与sc-N2A细胞中全局RNA编辑的增加和编辑转录本谱的扩展相关。APOBEC1耗竭显著降低了整体编辑水平，同时影响A-to-I和C-to-U编辑事件，重塑了与RNA和蛋白质运输、细胞应激反应、突触信号传导和神经免疫相互作用相关转录本的编辑模式。一致地，Apobec1基因敲除小鼠在接受RML朊病毒感染后表现出加速的体重下降和显著缩短的生存时间。

结论

这些发现支持APOBEC1作为RNA编辑稳态的贡献者，并提示APOBEC1缺失降低了对朊病毒诱导的神经退行性应激的抵抗力。APOBEC1缺陷与朊病毒感染细胞中改变的编辑组谱和RML朊病毒模型中加速的疾病进展相关。

引言

朊病毒疾病是一种无法治愈、快速进展且致命的神经退行性疾病（ND），影响人类和其他哺乳动物[1]、[2]、[3]。在人类中，主要的朊病毒疾病是库鲁-雅各布病（CJD）[4]，而牛海绵状脑病（BSE）和羊瘙痒症则是研究最为广泛的动物形式[5]。

核心致病事件是细胞朊蛋白PrP^C向PrP^Sc的转化，PrP^Sc是一种错误折叠、富含β-折叠且具有聚集倾向的异构体，构成感染性因子[3]、[6]、[7]。PrP^Sc的特征是在温和去污剂中溶解度降低，对蛋白酶K消化和热的抗性增加，并具有形成淀粉样纤维的高度倾向性[3]、[7]。这些特性促进了朊病毒的稳定性和在中枢神经系统（CNS）中的进行性积累，导致海绵状变性、小胶质细胞和星形胶质细胞激活以及神经元丧失[3]、[6]、[8]、[9]。尽管取得了重大进展，朊病毒的传播、感染性以及由PrP^C向PrP^Sc转化所触发的机制仍 largely 未知[10]。由于人类朊病毒疾病以漫长的无症状潜伏期、快速的临床进展和有限的人类活体组织可获得性为特征，体外和体内模型在界定疾病机制方面仍然至关重要。在此背景下，我们调查了转录后RNA修饰，特别是RNA编辑，是否对朊病毒发病机制有贡献。

RNA编辑是一种共转录和/或转录后分子机制，催化腺苷酸到肌苷酸（A-to-I）和胞苷酸到尿苷酸（C-to-U）的去氨基化，从而扩大转录组多样性[11]、[12]、[13]、[14]。A-to-I编辑由ADAR家族催化，而C-to-U编辑由APOBEC酶介导，产生RNA与DNA之间的差异[15]、[16]、[17]。编辑的功能后果取决于RNA种类以及在转录本中修饰的具体核苷酸位置，已记录到对RNA结构、稳定性和加工的影响[14]。编辑活性以组织依赖性、发育依赖性和细胞类型依赖性的方式受到严格调控，反映上下文特异性[18]、[19]、[20]、[21]。

在各种神经退行性疾病（ND）中观察到改变的RNA编辑，包括阿尔茨海默病（AD）[22]、[23]、[24]、[25]、[26]，帕金森病（PD）[27]、[28]、[29]，肌萎缩侧索硬化症（ALS）[30]、[31]、[32]、[33]、[34]，以及朊病毒疾病[35]、[36]、[37]，受损的编辑景观与突触功能障碍、免疫激活和线粒体应激相关[14]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]。编辑水平经常受到干扰，在编码区再编码事件和非编码3'UTR编辑中均可测量到偏移，后者影响RNA稳定性、定位和翻译。特定神经元亚型中不同的RNA编辑模式与这些细胞的选择性易感性相关，如在散发性库鲁-雅各布病和朊病毒疾病模型中所观察到的[35]、[36]、[37]、[43]。研究进一步表明，编辑相关酶活性降低会恶化神经炎症反应并加速神经退行性变化[39]、[44]。重要的是，旨在恢复正常RNA编辑模式的新兴治疗策略支持了这一调控层次的重要性[45]、[46]、[47]、[48]。

在人类组织中最多的器官中，大脑被认为是编辑程度最高的器官之一，编辑事件在神经发育和神经元功能中发挥关键作用[40]、[49]。ADAR家族由三个成员组成，其中两个（ADAR1和ADAR2）作为A-to-I催化酶发挥作用，而第三个（ADAR3）催化活性不活跃，作为调节因子发挥作用[50]、[51]。APOBEC家族由11个主要基因产物及其选择性剪接变体组成，包括APOBEC-1、AID、APOBEC-2、APOBEC-3A-H和APOBEC-4，其中APOBEC-1作为主要催化酶发挥作用[17]、[52]。

尽管ADAR缺失导致胚胎致死[40]，但小鼠中APOBEC耗竭是可存活的，并且在稳态和激活条件下表现出受扰的免疫功能[17]、[53]，特别是在神经退行性疾病中[44]、[54]。中枢神经系统中的免疫反应与常驻巨噬细胞紧密相关[55]、[56]。小胶质细胞是大脑中的巨噬细胞，执行蛋白质聚集体的吞噬等核心功能[57]，并越来越被认可为稳态维持和神经退行性病理的关键贡献者[56]。

在本研究中，慢性瘙痒症感染的小鼠神经母细胞瘤细胞（sc-N2A）被用作朊病毒疾病的体外模型，其特征为PrP^Sc的稳定表达，并与正常N2A细胞进行比较，后者过表达PrP^C[58]、[59]、[60]。利用RNA干扰敲低APOBEC1表达。为进一步在体内检验APOBEC1的相关性，将C57BL/6 Apobec1基因敲除小鼠腹腔接种落基山实验室（RML）朊病毒株[61]、[62]、[63]，并监测疾病进展。

我们的研究将APOBEC1确定为神经元系统中RNA编辑稳态的潜在调节因子，以及宿主对朊病毒感染反应的关键组成部分。朊病毒感染与广泛的转录组和RNA编辑改变相关，而APOBEC1缺失与进一步的编辑组重塑和体内加速的疾病进展相关。这些发现支持APOBEC1相关的RNA编辑作为朊病毒疾病中的候选调控层次，而进一步的机制研究将需要确定其直接靶标和功能后果。

章节摘要

shRNA质粒和apobec1敲低细胞系的构建

APOBEC1敲低使用从Hannon Lab/DHARMACON资源获得的shRNA进行。使用shRNA Wizard?在线工具（InvivoGen）生成的乱序shRNA作为匹配对照。对照和Apobec1敲低细胞经历相同的实验流程，包括shRNA克隆到pGIPZ载体、转染、GFP阳性克隆筛选和扩增。因此，乱序-shRNA对照细胞作为控制非特异性效应相关的基线比较器

朊病毒感染sc-N2A细胞显示全局RNA编辑增加

确定了非感染性N2A和朊病毒感染sc-N2A细胞的高置信度RNA编辑事件（附加文件2）。ADAR介导的编辑在两个细胞系中均为主要编辑类型（图1A），sc-N2A细胞显示向ADAR相关编辑较高和APOBEC相关编辑较低的适度偏移（图1B）。共享编辑位点的逐位点比较显示，sc-N2A细胞中的编辑频率显著高于对照（图1C），同时具有更多的独特编辑位点

讨论

RNA编辑是神经退行性中的重要转录后机制。ADAR酶催化的腺苷酸到肌苷酸（A-to-I）编辑和APOBEC酶催化的胞苷酸到尿苷酸（C-to-U）编辑均可使RNA序列多样化并调控基因表达[11]、[73]。在多种神经退行性疾病（ND）中报告了改变的RNA编辑模式，包括朊病毒疾病[14]、[35]、[36]。我们课题组先前的工作显示广泛且阶段依赖性的RNA编辑改变

CRediT作者贡献声明

Korina Karagianni：撰写 – 初稿，可视化，方法学，调查，形式分析，数据整理。Eirini Kanata：撰写 – 审阅与编辑，方法学，数据整理。Eleni Kovatsi：调查。Spyros Pettas：撰写 – 初稿。Mantiana Topouzi：撰写 – 初稿。Konstantinos Xanthopoulos：撰写 – 审阅与编辑，监督，概念化。Theodoros Sklaviadis：撰写 – 审阅与编辑，监督，概念化。Dimitra Dafou：撰写 –

伦理批准

所有动物研究均按照机构和国家法规进行。该方案经IACUC和地方兽医服务部门批准（方案编号：3154 / 17-12-2015）。

重要性声明：APOBEC1相关的RNA编辑代表了朊病毒疾病中先前未充分探索的调控层次，将编辑组稳态与神经系统在神经退行性应激期间抵抗力和疾病进展联系起来。

资金

K.K.感谢希腊研究创新基金会（H.F.R.I.）在第四批H.F.R.I.博士奖学金计划下的资金支持（奖学金编号：10829）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的与本文报告的工作相关的竞争性财务利益或个人关系。

Korina Karagianni|Eirini Kanata|Eleni Kovatsi|Spyros Pettas|Mantiana Topouzi|Konstantinos Xanthopoulos|Theodoros Sklaviadis|Dimitra Dafou