《Journal of Basic Microbiology》：A Systematic Method for Analysing Germination of Aspergillus Conidia Using Real-Time Imaging
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活细胞成像(live cell imaging)是微生物研究中用于研究群落互作、形态发育和群体差异的有用工具。在此，研究人员旨在开发一种新方法，以在个体水平监测丝状真菌萌发所需时间和菌丝发育速率。研究人员将19种曲霉属(Aspergillus)物种（包括一些嗜
活细胞成像(live cell imaging)是微生物研究中用于研究群落互作、形态发育和群体差异的有用工具。在此，研究人员旨在开发一种新方法，以在个体水平监测丝状真菌萌发所需时间和菌丝发育速率。研究人员将19种曲霉属(Aspergillus)物种（包括一些嗜干性(xerophilic)物种）的分生孢子(conidia)悬浮于液体Sabouraud培养基中，并使用实时成像(real-time imaging)追踪分生孢子96 h。研究人员开发了一种分选算法(sorting algorithm)，基于圆度(circularity)下降和面积(area)增加将分生孢子归类为萌发(germinated)或未萌发(non-germinated)池。分选算法中使用的面积增加具有物种特异性(species-specific)，并通过分段线性回归(segmented linear regression)推导，以确定面积增加的拐点(inflection point)，其作为从各向同性生长(isotropic growth)向极化生长(polarized growth)转变的代理指标。在测定的19种物种中，15种在96 h内萌发。在萌发物种中，研究人员测量了直至实验终止或分生孢子离开成像框(imaging frame)的菌丝生长速率(hyphal growth rate)。菌丝生长速率既在单个分生孢子水平计算，也使用萌发后24 h内数据的生长模型计算。该方法在比较萌发指标时实现了高通量(high-throughput)、物种特异性和个体化方法。用于监测真菌萌发和菌丝生长速率的活细胞成像方法为研究真菌发育提供了重要框架，并有可能对传统终点分析(endpoint assays)可能忽视的早期真菌生长提供深入见解。
研究背景与问题：丝状真菌(filamentous fungi，以菌丝体生长的真菌)是文化遗产人工制品生物劣化(bio-deterioration)、食品腐败、室内空气污染以及其他经济与健康影响的重要贡献者。由于早期发育是真菌控制策略的关键靶点，准确量化萌发(germination)和菌丝发育(hyphal development)至关重要。然而，实时、单细胞水平量化这些早期发育过程仍是挑战；现有方法多依赖终点分析(endpoint assays，实验终点一次性测定)，遗漏早期动态。实时定量和高通量(high-throughput)萌发指标分析将加强未来真菌研究。曲霉属(Aspergillus)分生孢子(conidia，无性繁殖孢子)萌发经历三个形态阶段：休眠(dormancy)、各向同性生长(isotropic growth，均匀径向膨胀)和极化生长(polarized growth，局部尖端伸长)。不同物种萌发不一致，温度、水活度、光、pH和分生孢子密度等也影响萌发。因此，研究人员旨在开发活细胞成像(live-cell imaging)方法，在单个分生孢子水平量化萌发延迟时间(germination lag time)、各向同性膨胀程度、菌丝生长速率和萌发分生孢子比例。研究人员将19种曲霉属物种（包括嗜干性(xerophilic，适应低水活度)物种）的分生孢子悬浮于液体Sabouraud培养基，在16 °C下用oCelloScope实时成像96 h，并开发分选算法(sorting algorithm)将单个分生孢子归类为萌发或未萌发。15种在96 h内萌发。该方法实现高通量、物种特异性和个体化比较，为研究真菌发育提供框架，并可能揭示传统终点分析忽视的早期真菌生长，用于抗真菌处理评估和环境条件研究。
关键技术方法：研究人员将19种曲霉属菌株分生孢子悬浮于液体Sabouraud培养基，在16 °C下用oCelloScope进行96 h实时成像，每1–4 h采集图像，每物种三复孔、实验重复两次。样本来源：A. niger来自生物燃料厂室内空气，A. versicolor来自温室室内空气，均经MALDI-TOF MS鉴定；17种嗜干性Aspergillus spp.来自丹麦技术大学(DTU)生物技术研究所(IBT)培养物保藏中心，均属Restricti组。使用UniExplorer软件的真菌萌发测定和分割/对象追踪模块获取面积、圆度、总长度等指标；在RStudio中建立分选算法，以圆度下降和物种特异性临界面积倍数，结合分段线性回归确定各向同性向极化生长转变；计算线性和指数菌丝生长率。算法在GitHub公开。
研究结果：
3.1 各向同性生长期间分生孢子面积倍数变化（Area Fold Change of Conidia During Isotropic Growth）：通过分段线性回归对单个分生孢子面积随时间变化建模，排除未萌发分生孢子，仅纳入面积增加至少2.5倍者。结果得到物种特异性临界面积倍数和断点时间；面积倍数约1.359±0.017（A. vitricola）至2.637±0.447（A. villosus），断点时间约22.41±2.52 h（A. niger）至67.93±1.38 h（A. canadensis）。为减少假阳性，分选算法将临界面积倍数设为断点值的1.25倍。结论：面积增加拐点可作为各向同性生长向极化生长转变的代理指标。
3.2 萌发分选算法验证（Germination Sorting Algorithm Verification）：通过随机选取4个实验、17个物种，将算法识别的萌发事件与对应图像人工比对，并绘制萌发与未萌发分生孢子总菌丝长度随时间变化图。结果确认分选算法能准确识别萌发时间点。19种中15种在96 h内萌发；A. clavatophorus、A. halophilicus、A. magnivesiculatus和A. hordei未萌发，未进一步分析。
3.3 萌发延迟时间（Germination Lag Time）：通过分选后单个分生孢子萌发延迟时间分布分析，发现种间可变；例如A. niger为24.83±0.24 h，A. canadensis为79.08±3.18 h。临界面积倍数与萌发延迟无显著相关(p=0.092)；算法识别的萌发延迟与分段线性回归断点时间显著相关(p=1.677×10
?12)。
3.4 菌丝生长速率（Hyphal Growth Rate）：对每个萌发分生孢子，根据萌发至最后记录时间点长度增加计算线性与指数生长率；并对萌发后24 h平均菌丝长度拟合指数生长模型。结果种间差异大；A. niger最快，指数生长率0.162±0.013 H
?1、线性生长率5.05±0.73 μm·H
?1；A. penicillioides最慢，指数0.013±0.000 H
?1、线性0.17±0.01 μm·H
?1，前者指数约12倍、线性约29倍。临界面积倍数与线性生长率正相关(p=0.010)，与指数生长率呈趋势(p=0.054)；生长率与萌发延迟负相关(线性p=5.819·10
?8，指数p=2.502·10
?8)。A. destruens形成萌发管但未发育成熟菌丝。
3.5 96 h内萌发分生孢子百分比（Percent of Total Conidia Germinated in 96 h）：通过oCelloScope真菌萌发测定模块计数，得出各物种96 h萌发百分比。萌发百分比与线性(p=5.57·10
?8)和指数生长率(p=5.31·10
?9)相关，与萌发延迟负相关(p=1.78·10
?8)；萌发异质性(heterogeneity，萌发时间分散程度)与线性、指数生长率(p=0.011, p=0.006)及萌发延迟(p=0.002)相关。
讨论与结论：讨论部分指出，17种嗜干性物种生长较慢且遗传多样，适合算法开发，并包括室内环境新兴关注物种；A. niger和A. versicolor萌发较快，除A. pachycaulis外。Sabouraud培养基虽非嗜干性选择培养基，但常用于环境真菌样品和MALDI-TOF鉴定。各物种各向同性膨胀差异对分选阈值提出挑战，分段线性回归误标最少，1.25倍阈值降低假阳性。膨胀程度与后续线性菌丝生长率正相关，但与萌发延迟和萌发百分比无关。4种未萌发中3种位于同一系统发育支系；A. destruens形成萌发管但未成熟。方法局限包括分生孢子漂出成像框被默认归为未萌发、液体静态培养不代表固体或空气生长、亮场图像分割和简单形状描述符限制、聚集分生孢子可能漏检；未来可自适应过滤或荧光标记。该方法可用于评估抗真菌处理、环境条件、文化遗产生物劣化和食品腐败等。
翻译研究结论部分：通过使用所开发的分选算法，研究人员能够系统比较15种不同曲霉属(Aspergillus)分生孢子(conidia)的多种生长指标。算法准确性通过图像和菌丝长度随时间变化图进行视觉验证。总体而言，所选曲霉属物种在Sabouraud培养基中生长时，萌发延迟时间(germination lag time)存在变异，且菌丝(hypha)生长速率与各向同性膨胀(isotropic swelling)大小显著相关。本文描述的方法可应用于更大规模研究以简化分析。此外，该方法能够在单个分生孢子水平比较不同生长条件、杀真菌剂(fungicides)或种间竞争(interspecies competition)对纯或混合分生孢子样品的影响。为该项目开发的算法已通过GitHub存储库(https://github.com/NFA-NRCWE/fungal_germination_identification)以R和Python形式公开。
