犬瘟热病毒（CDVOnd）感染在模拟实体瘤不同区域的体外模型中诱导犬组织细胞肉瘤细胞（DH82）转录组重塑

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Canine Distemper Virus-Induced Transcriptional Modulation of Canine Histiocytic Sarcoma Cells in an In Vitro Model of Tumour Zones

犬瘟热病毒（Onderstepoort株；CDV_Ond）显示出潜在的溶瘤特性。然而，迄今详细的分子机制仍未明确。本研究探讨了CDV_Ond感染及多种培养条件在不同时间点对犬组织细胞肉瘤（canine histiocytic sarcoma, DH82）细胞基因表达模式的影响，以模拟实体瘤内的不同区域。持续性CDV_Ond感染的DH82细胞和未感染对照在标准条件、1%缺氧（hypoxia）和饥饿（starvation）条件下培养。研究人员在第1天（短期）和第3天（长期暴露）通过增殖试验和RNA测序（RNA sequencing, RNAseq）分析细胞。感染细胞数量在改变条件下较对照条件显著减少，并且长期暴露后较短期暴露显著减少。富集分析显示，与未感染对照相比，持续性CDV感染在所有条件和时间点均上调与免疫过程相关的基因，并下调组织发育通路，包括血管生成（angiogenesis）。与维持在对照条件下的感染细胞相比，缺氧和饥饿诱导了不同的、条件依赖的转录组反应，且与暴露时间无关。缺氧导致免疫相关过程受抑制并促进血管生成，而饥饿则呈现相反模式。这表明CDV感染在所有区域诱导转录组改变，提示抗肿瘤效应，而微环境条件可能影响基于CDV的病毒疗法（virotherapy）的疗效。

犬组织细胞肉瘤（canine histiocytic sarcoma, HS）是犬的实体恶性肿瘤，以巨噬细胞或树突状细胞增殖为特征，可表现为局部或播散形式，常与不良预后相关，尤其当累及中枢神经系统（central nervous system, CNS）时。当前治疗选择有限，主要包括手术切除、化疗或放疗及支持性治疗。实体瘤中常见的缺氧和饥饿，尤其中心区域，构成重要治疗障碍。肿瘤缺氧和饥饿影响肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME），可通过增强血管生成和改变肿瘤细胞代谢增加侵袭性。溶瘤病毒疗法利用溶瘤病毒选择性感染和破坏肿瘤细胞，同时保护健康组织，成为有前景的策略。犬瘟热病毒（canine distemper virus, CDV；Morbillivirus canis）属于副黏病毒科麻疹病毒属，疫苗株Onderstepoort（CDV_Ond）在鼠异种移植模型中显示抑制肿瘤生长、增加瘤内坏死，并可增强免疫反应、改变基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）及其抑制剂、减少血管生成和转移。然而，关于溶瘤病毒治疗后肿瘤细胞在不同TME条件下，尤其实体瘤中心区域局部缺氧和饥饿时的转录组改变知之甚少。因此，研究人员旨在体外研究病毒感染肿瘤细胞在模拟实体瘤不同区域培养条件下的影响，假设溶瘤病毒治疗应用和TME差异可能诱导特定转录改变，从而影响治疗疗效。

关键技术方法：研究使用犬组织细胞肉瘤细胞DH82（ECACC No. 94062922）及持续性CDV_Ond感染DH82细胞（DH82_Ondpi，感染率超过90%，使用第143代）。细胞在标准、1% O₂缺氧、无胎牛血清饥饿条件下培养1天和3天。采用增殖试验计数细胞，RNA测序分析转录组，DESeq2鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），DAVID进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，并使用iDEP、Pathview和ggplot2等可视化。非感染细胞数据来自同一实验条件下已发表数据集。

研究结果：

3.1 感染和培养条件影响细胞增殖。通过增殖试验发现，标准条件下DH82_Ondpi细胞数在1天和3天均显著高于非感染细胞。缺氧下，第1天感染与非感染细胞无显著差异，第3天感染细胞显著低于非感染对照。饥饿下，第1天感染细胞显著高于非感染细胞，第3天感染细胞数低于第1天且与非感染对照无显著差异。与标准条件相比，缺氧下感染细胞在两个时间点均显著降低，饥饿下第3天显著降低。随时间变化，感染细胞从第0天到第1天在所有条件下显著增加，但从第1天到第3天在缺氧和饥饿下显著减少。结论为感染和培养条件影响细胞增殖，改变条件下感染细胞数量减少。

3.2 持续性CDV感染重塑全局转录组景观。通过RNA测序和主成分分析（principal component analysis, PCA）发现，感染与未感染细胞明显分离，并按培养条件和暴露时间聚类。DEGs数量随比较不同而变化，感染细胞始终比非感染细胞有更多DEGs，尤其饥饿条件下最多。标准条件第1天和第3天分别有2948和2918个DEGs，缺氧第1天和第3天分别有3084和3138个DEGs，饥饿第1天和第3天分别有3700和3388个DEGs。

3.3 功能富集分析揭示持续性CDV感染相比未感染细胞的广泛转录重编程。与未感染对照相比，所有条件和时间点感染细胞均上调免疫反应、防御反应、刺激反应和信号转导相关GO术语，KEGG上调趋化因子信号、Toll样受体、JAK-STAT、Rap1和Nod样受体信号及流感、麻疹、单纯疱疹病毒等通路。下调GO和KEGG主要与发育过程相关，尤其血管生成、细胞黏附、细胞周期、代谢、PI3K-Akt和Ras信号。缺氧下，感染细胞上调免疫调节及应激反应，KEGG富集Toll样、RIG-I样、Nod样和TNF信号，下调细胞外基质组织、细胞黏附、PI3K-Akt和癌症进展；长期缺氧上调细胞增殖和丝分裂细胞周期。饥饿下，短期暴露转录组变化最强，上调免疫反应、防御、病毒反应和细胞因子信号，下调新血管形成和细胞黏附；KEGG显示病毒感染和免疫信号激活，代谢、黏附和癌症通路抑制；长期饥饿额外上调细胞周期并下调细胞运动。

3.4 持续性CDV感染下实验条件间共享的富集GO术语和重叠DEGs。通过重叠DEGs分析，所有条件感染细胞相比未感染对照，共享63个上调DEGs，与免疫系统过程调节相关；共享49个下调DEGs，与循环系统发育相关。

3.5 持续性感染细胞中培养条件依赖的转录调制与对照条件比较。与感染细胞对照条件相比，缺氧主要下调免疫相关基因；短期缺氧上调发育和血管生成，长期缺氧上调细胞周期、凋亡、细胞运动、血管发育和应激反应。相反，短期饥饿激活免疫系统和趋化相关基因，抑制发育尤其循环系统和增殖；长期饥饿上调细胞周期、免疫系统过程、应激和代谢过程，下调组织和循环系统发育及细胞黏附。KEGG分析显示，短期缺氧上调TNF信号、癌症通路、PI3K-Akt、NF-κB、MAPK等；短期饥饿上调细胞因子-细胞因子受体相互作用、EBV感染、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用等，下调细胞群体增殖负调控；长期缺氧上调细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞周期、IL-17信号、TNF等，下调单纯疱疹病毒1型感染、EBV感染、流感A、钙信号、NOD样受体信号、抗原加工和呈递等；长期饥饿上调细胞周期、DNA复制、细胞因子-细胞因子受体相互作用等，下调癌症中心碳代谢、癌症通路、Ras信号。随时间比较显示，对照条件下调细胞周期、DNA复制等；缺氧随时间下调类固醇生物合成、趋化因子信号、EBV感染等；饥饿随时间下调类固醇生物合成、细胞周期、DNA复制等。

讨论部分总结：CDV显示出有前景的溶瘤潜力，本研究聚焦持续性CDV感染犬组织细胞肉瘤细胞在不同条件下的转录组变化，以模拟实体瘤不同区域的病毒治疗反应。感染与非感染细胞比较模拟病毒治疗对未感染肿瘤细胞的影响，感染细胞跨培养条件比较反映治疗后区域特异性适应及潜在抵抗。持续性感染率超过90%以确保最大效应，短期和长期暴露分别模拟中间和中心肿瘤区域，标准条件模拟肿瘤周边。研究发现感染细胞DEGs更多，尤其短期饥饿最多，提示CDV感染可能增加细胞对环境应激的敏感性并增强转录反应，表明感染肿瘤细胞对营养剥夺具有快速适应能力。功能富集显示，所有条件下上调基因主要涉及免疫过程、防御反应、刺激反应和促炎反应，尤其病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern, PAMP）通路如Toll样受体（TLR）、Nod样受体（NLR）和RIG-I样受体（RLR）信号。免疫系统过程调节是最一致富集的生物学过程，提示CDV感染核心细胞反应独立于培养条件，可能增强实体瘤所有区域免疫通路激活。DDX60基因在所有条件下最上调，可能参与CDV诱导抗病毒反应并与肿瘤进展和免疫信号相关。下调基因中PARVA最下调，其参与肿瘤进展、血管生成和转移，支持PARVA下调可能贡献CDV感染后的抗血管生成效应。CDV感染还降低代谢和癌症通路包括PI3K-Akt信号。区域特异性方面，模拟中心区缺氧和营养缺乏伴随细胞数量下降，但缺氧富集细胞运动和血管发育，下调免疫相关过程，提示适应性转录重塑可能与肿瘤进展相关，同时细胞死亡过程也上调。饥饿主要上调细胞周期和免疫系统过程，下调循环系统发育，可能增强溶瘤疗效。中间区类似中心区，增殖、免疫、血管生成和癌症通路失调，表明病毒溶瘤特性受微环境条件影响。缺氧下免疫系统激活减少可能限制溶瘤病毒治疗疗效，但缺氧诱导肿瘤细胞坏死可能增强抗原性并增加炎症细胞浸润。研究结论翻译：总之，本研究表明CDV感染在犬组织细胞肉瘤细胞中根据培养条件诱导转录组改变，表明实体瘤中溶瘤病毒治疗的肿瘤区域特异性反应。值得注意的是，CDV感染在所有模拟肿瘤区域引发保守核心效应，包括激活免疫反应和抑制血管生成，突出其治疗潜力。此外，缺氧可能是溶瘤病毒治疗后肿瘤进展的主要原因，通过激活血管生成和癌症进展通路等多种机制促进肿瘤进展和转移。但需考虑本研究关注持续性CDV感染细胞，感染率超过90%，持续感染可能引起表观遗传和/或转录组改变，而急性感染可能不发生，限制结果向体内自发犬组织细胞肉瘤治疗的外推。因此，需要进一步研究包括离体自发犬组织细胞肉瘤样本的急性感染，以阐明潜在机制并鉴定治疗靶点或联合策略，从而提高CDV为基础病毒疗法在犬组织细胞肉瘤及潜在其他恶性肿瘤中的疗效。