可再生视网膜出生后生理性神经发生、发育与成熟：Axolotl视网膜神经元密度重塑、成熟梯度及兴奋性-抑制性信号增强

《Journal of Comparative Neurology》：Physiological Postnatal Neurogenesis, Development, and Maturation in the Regenerable Retina

　　

视网膜在墨西哥钝口螈（Axolotls）中出生后扩大～440%，在人类中扩大～150%；若神经发生缺失，预计神经元密度分别降低81.5%和60%。同步发生的视网膜重塑尚缺乏充分表征。研究人员研究了2–15 cm墨西哥钝口螈的视网膜。结果显示，孵化幼体（～2 cm）视网膜，尤其周边（Peri），在神经节细胞层（GCL）以及外核层（ONL）和内核层（INL）多1–2排胞体。在幼体（4–12 cm）中，GCL内细胞密度降低（神经节细胞（GCs），?49%），但在年轻幼体（4–6 cm）中，INL（74%）和ONL（55.5%）内细胞密度增加，表明存在强烈的神经发生。幼体中央视网膜（Cnt）增厚（47 μm），光感受器外段（OSs）伸长（32 μm）。与Cnt中的1.6–0.4相比，2–6 cm动物的Peri具有更多未分化细胞（三角形双皮质素（DCX）⁺⁺⁺；柱状DCX⁺/谷氨酰胺合成酶（GS）⁺或DCX^?/GS⁺），并且无长突细胞（ACs）/视锥细胞、双极细胞（BCs）/视锥细胞、视杆细胞/视锥细胞和GCs/视锥细胞的密度比分别更高，为4.4–2.1、1.9–1.7、1.6–1和2–0.6。较老动物中视杆细胞、水平细胞和推定的OFF双极细胞（OFFBCs）的双链（ds）DNA信号类似未成熟神经元。这提示成熟顺序为GCL > ONL > INL、Cnt > Peri，以及视锥细胞和ON通路 > 视杆细胞和OFF通路。S-视蛋白和L/M-视蛋白在幼体中达到峰值，显示L/M-视蛋白⁺视锥细胞、S-视蛋白⁺视杆细胞和视锥细胞，以及具有较薄或较厚OS的弱L/M-视蛋白⁺视杆细胞。Cx36在4–15 cm动物中增加。晚幼体（7–12 cm）中GABA信号最大，并被光增强，显示ACs、视杆终球和Müller细胞，提示更强的GABA释放和转运。因此，视网膜经历关键的孵化后发育，生成神经元并增强兴奋性信号、电耦合和抑制性调控。

论文解读：可再生视网膜出生后生理性神经发生、发育与成熟

研究背景与问题。墨西哥钝口螈（Axolotl，Ambystoma mexicanum）像其他蝾螈一样，是视网膜再生研究的重要模型，其神经元较大、可及性好，并具有卓越的再生能力，可再生的组织包括尾巴、脊髓、肢体、骨骼以及包括整个视网膜在内的眼球。脊椎动物视网膜再生涉及三种机制：睫状边缘区（CMZ，ciliary marginal zone）中视网膜干细胞（RSCs，retinal stem cells）和视网膜祖细胞（RPCs，retinal progenitor cells）的损伤诱导激活；视网膜色素上皮（RPE，retinal pigmented epithelium）的自发重编程；以及Müller细胞（Müller glia）的重编程。病理性视网膜再生与生理性神经发生高度可比，因为二者均利用CMZ中相同的RSCs和RPCs。视网膜神经元类别的出生顺序为：先视网膜神经节细胞（RGCs），后水平细胞（HCs）、视锥细胞、无长突细胞（ACs）和视杆细胞，最后双极细胞（BCs）和Müller胶质。该顺序在包括鸡、斑马鱼、小鼠、大鼠和灵长类等多种脊椎动物中常见。生理性视网膜组织发生在中央视网膜早于周边视网膜开始和结束。哺乳动物小鼠、大鼠和灵长类通常在出生后1–2周内完成；而鱼和两栖动物视网膜在其大部分寿命中通过CMZ外周生成新细胞环而持续生长。中央到周边发育模式已在斑马鱼胚胎、非洲爪蟾胚胎和成年金鱼视网膜中得到证明。然而，蝾螈视网膜出生后生理性神经元网络重塑仍缺乏详细记录，现有研究常集中于CMZ持续神经发生和损伤后再生。人类和幼年蝾螈出生后眼球均增大，导致视网膜表面积增加和神经网络重塑；若缺乏神经发生，墨西哥钝口螈和人类视网膜神经元密度预计分别降低81.5%和60%。因此，研究人员需要表征生长中视网膜的结构和分子发育事件，以理解视觉形成和再生。

关键技术方法概述。样本来自美国肯塔基大学Ambystoma Genetic Stock Center（AGSC），包括～2 cm孵化幼体、4–6 cm年轻幼体、7–12 cm晚幼体和～15 cm成体前墨西哥钝口螈。研究人员采用视网膜整体铺片和垂直切片，进行双重和三重免疫标记，并结合TO-PRO-3双链DNA染色、视蛋白、Cx36和抑制性神经元分子标记，分析神经元密度、核层、光感受器外段、视蛋白、Cx36和GABA信号等。所有动物维持在12 h光/暗循环，实验遵循联邦和机构规定并经Baylor College of Medicine动物伦理委员会批准。

研究结果。据摘要，结果可归纳如下：
第一，视网膜扩大与神经元密度。孵化幼体（～2 cm）视网膜，尤其周边（Peri），GCL、ONL和INL多1–2排胞体。幼体4–12 cm中GCL的GCs密度降低?49%；年轻幼体4–6 cm中INL和ONL密度分别增加74%和55.5%，表明强烈神经发生。
第二，中央与周边结构成熟。幼体中央视网膜（Cnt）增厚47 μm，光感受器外段（OSs）伸长32 μm。
第三，未分化细胞与细胞密度比。2–6 cm动物Peri具有更多未分化细胞（三角形DCX⁺⁺⁺；柱状DCX⁺/GS⁺或DCX^?/GS⁺），且ACs/视锥细胞、BCs/视锥细胞、视杆细胞/视锥细胞和GCs/视锥细胞密度比分别达4.4–2.1、1.9–1.7、1.6–1和2–0.6，高于Cnt的1.6–0.4。
第四，dsDNA信号与成熟顺序。较老动物视杆细胞、水平细胞和推定OFFBCs的dsDNA信号类似未成熟神经元；提示成熟顺序GCL > ONL > INL、Cnt > Peri，以及视锥细胞和ON通路 > 视杆细胞和OFF通路。
第五，视蛋白表达。S-视蛋白和L/M-视蛋白在幼体达峰值，显示L/M-视蛋白⁺视锥细胞、S-视蛋白⁺视杆细胞和视锥细胞，以及具有较薄或较厚OS的弱L/M-视蛋白⁺视杆细胞。
第六，Cx36表达。Cx36在4–15 cm动物中增加。
第七，GABA信号。晚幼体7–12 cm中GABA信号最大，并可被光增强，显示ACs、视杆终球和Müller细胞，提示更强GABA释放和转运。

讨论与结论。据摘要，讨论部分强调出生后视网膜经历关键发育，生成神经元，并增强兴奋性信号、电耦合和抑制性调控。该研究为理解可再生视网膜的生理性发育、成熟和视觉形成提供基础。研究结论翻译为：因此，视网膜经历关键的孵化后发育，生成神经元并增强兴奋性信号、电耦合和抑制性调控。