《The Journal of Gene Medicine》：CRISPR/Cas9-Mediated Correction of the SLC25A38 Mutation in a Patient With Sideroblastic Anemia
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背景：SLC25A38是血红素生物合成途径的基因之一，其破坏性改变导致常染色体隐性先天性铁粒幼细胞性贫血（CSA）。患者来源的原代成纤维细胞可作为疾病建模、细胞治疗研究和诱导多能干细胞（iPSCs）生成的宝贵来源。此外，它们易于分离并在体外快速生长。因此，在这
背景：SLC25A38是血红素生物合成途径的基因之一，其破坏性改变导致常染色体隐性先天性铁粒幼细胞性贫血（CSA）。患者来源的原代成纤维细胞可作为疾病建模、细胞治疗研究和诱导多能干细胞（iPSCs）生成的宝贵来源。此外，它们易于分离并在体外快速生长。因此，在这些细胞中进行有效的基因校正可能是迈向个性化治疗的重要一步。
方法：在本研究中，研究人员从CSA患者中分离出成纤维细胞，进行染色、流式细胞术测定和免疫细胞化学（ICC）检测。随后，使用Lipofectamine进行转染优化。
结果：用Cas9/sgRNA3表达质粒和单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体转染24小时后，转染效率达到49.64%。通过PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测靶基因区域中ssODN供体的存在，观察到两个大小约为116和161 bp的片段。这些结果与从患者分离的成纤维细胞中ssODN供体插入靶基因区域一致。
结论：本研究发现表明，在所测试条件下，使用CRISPR/Cas9系统与设计的寡核苷酸供体组合，有可能在患者成纤维细胞中的靶基因位点产生预期变化。使用测序的补充研究，以及检查不同的转染条件，可能有助于更准确地确认本研究的发现，并进一步优化该方法以供未来研究。
铁粒幼细胞性贫血是一组以骨髓中环状铁粒幼细胞为特征的骨髓疾病，其常染色体隐性遗传形式即为先天性铁粒幼细胞性贫血（CSA）。SLC25A38基因编码线粒体转运蛋白，参与血红素生物合成，其致病性突变可导致严重的非综合征型CSA，患者常需依赖定期输血和铁螯合治疗。目前，异基因造血细胞移植（allo-HCT）是唯一的常规治疗手段，但存在移植物抗宿主病（GvHD）、人类白细胞抗原（HLA）配型困难以及缺乏合适供体时存活率降低等问题。因此，开发基于自体干细胞基因编辑的个性化治疗策略具有重要意义。CRISPR/Cas9系统作为一种精确的基因组编辑工具，可通过同源定向修复（HDR）在目标位点引入校正序列，为单基因遗传病的治疗提供了新途径。由于患者来源的原代成纤维细胞易于分离、体外增殖快，并可重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），研究人员选择该类细胞作为细胞模型，探索CRISPR/Cas9介导的SLC25A38突变校正的可行性。
研究人员从一名伊朗CSA患者（其症状和家族史此前已有报道）的皮肤活检中分离出原代成纤维细胞，并进行细胞鉴定；随后设计了一个79核苷酸的单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体，包含将突变T校正为野生型C的序列、两个PAM区沉默突变以及一个XbaI酶切位点；通过Lipofectamine将Cas9/sgRNA3表达质粒与ssODN共转染，优化转染条件，并利用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测靶位点是否发生预期的序列改变。研究结果显示，在优化的条件下，转染后24小时GFP阳性细胞达到49.64%，并在部分经嘌呤霉素筛选的细胞群体中检测到XbaI酶切产生的116 bp和161 bp片段，表明ssODN供体成功插入靶基因区域。该结果初步证明CRISPR/Cas9系统可在患者来源的成纤维细胞中靶向SLC25A38突变位点，为未来的基因治疗和细胞治疗策略提供了概念验证。
主要技术方法包括：从患者皮肤活检组织经外植体法原代培养获得成纤维细胞；通过倒置显微镜观察形态、生长曲线、Masson三色染色检测胶原、免疫细胞化学（ICC）检测波形蛋白，以及流式细胞术分析CD73、CD90、CD105和CD34表面标记物表达，以确认细胞身份；设计含校正碱基和沉默突变的ssODN供体，并采用Lipofectamine转染pX458-GFP或pX459-sgRNA3质粒及ssODN，通过梯度优化Lipofectamine量、质粒浓度、供体浓度和检测时间；以GFP阳性率评估转染效率，用嘌呤霉素筛选阳性细胞；提取基因组DNA后，PCR扩增包含靶点的277 bp片段，用XbaI酶切后经12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测校正片段。
研究结果如下：
3.1 分离和鉴定CSA患者特异性成纤维细胞：通过外植体法，组织块周围在7天后出现细胞，逐渐变为梭形并呈漩涡状排列，3-4周获得较均一的培养物。
3.2 细胞特性和活力：第3代细胞呈现贴壁梭形形态；第5代细胞生长曲线显示从第0天至第10天呈正常增殖动力学；Masson三色染色显示胶原沉积显著；ICC检测波形蛋白呈阳性；流式细胞术显示细胞显著表达CD73（99.9%）、CD90（98%）、CD105（99.9%），而CD34表达极低，符合成纤维细胞特征。
3.3 寡核苷酸供体设计：设计合成了ssODN供体序列，其中包含将突变T校正为C的碱基、PAM区两个沉默点突变以及引入XbaI酶识别位点，以便通过酶切检测供体整合。
3.4 Lipofectamine转染优化：通过固定变量逐步优化，当Lipofectamine为2.5 μL、质粒浓度为220 ng/μL、ssODN浓度为220 ng/μL，转染后24 h检测时，GFP阳性细胞率最高达49.64%；MTT实验确定嘌呤霉素适宜筛选浓度为1.5 μg/mL。
3.5 靶向患者成纤维细胞中c.166C>T突变：使用pX459-sgRNA3与ssODN共转染并经嘌呤霉素筛选后，9个细胞群体中有4个PCR-RFLP产物经XbaI酶切后出现116 bp和161 bp两个片段，而对照组仅见277 bp片段，提示供体模板插入并形成酶切位点。
讨论部分指出，CSA因遗传异质性和多系统受累使基因治疗疗效存在差异；针对SLC25A38的非综合征型CSA，校正造血干细胞或红系前体有望恢复血红素合成。尽管CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的基因校正已有成功尝试，但临床使用仍有局限，因此iPSCs和患者来源成纤维细胞成为重要模型。本研究中，成纤维细胞的身份通过形态、表面标记物和波形蛋白染色得到确认。CRISPR/Cas9靶向效率受递送条件和供体比例影响，RFLP和PAGE检测到预期条带提示编辑事件发生，但仍需Sanger测序精确确认，且未评估脱靶效应，样本仅来自一名患者，结果应视为初步证据。研究结论：CSA是一种与SLC25A38突变相关的严重常染色体隐性非综合征性疾病，多数患者需定期输血；本研究使用患者来源原代皮肤成纤维细胞作为细胞模型，证明pX459-sgRNA3与ssODN供体组合可靶向SLC25A38的c.166C>T变异位点，但需DNA测序准确确认编辑结果；该结果显示了在此细胞模型中应用CRISPR/Cas9靶向SLC25A38区域的可行性，为未来优化基因组编辑策略和评估CRISPR/Cas9在CSA中的治疗潜力奠定了基础。
