金头鲷（Sparus aurata）血浆前处理对细胞外囊泡RNA产量及长RNA货物谱的影响：exoRNeasy与Oxford Nanopore Technologies长读长测序的方法学评估

《Journal of Extracellular Biology》：Evaluating Plasma-Handling Effects on Extracellular Vesicle RNA Yield and Cargo Profiles in Fish: A Methodological Insight

细胞外囊泡（EV）来源RNA（EV-RNA）正在成为水生生物中有价值的生物标志物来源。然而，长RNA种类，尤其是信使RNA（mRNAs）和长非编码RNA（lncRNAs）的组成和稳定性，在硬骨鱼中仍很大程度上未被探索。输入血浆体积和储存条件等前分析因素可能影响RNA回收，尤其是在鱼类血浆等低输入样本中。在此，研究人员使用exoRNeasy商业化试剂盒评估了输入样本体积和冷冻储存对金头鲷（Sparus aurata）血浆中EV-RNA产量和完整性的影响。Maxi（约2 mL）和Midi（约1 mL）试剂盒形式均产生可比的RNA回收，表明血浆体积需求具有灵活性。冷冻未改变总体RNA生物类型组成或优势转录本身份，但导致更短和不完整异构体比例增加，提示长RNA在冷冻储存期间选择性易受降解。使用Oxford Nanopore Technologies长读长测序，研究人员生成了该物种首个长RNA解析的EV转录组。EV货物以核糖体mRNA和代谢mRNA为主，与保守的脊椎动物EV特征一致，并鉴定出302个不同的lncRNAs，其中两个占lncRNA读数的近90%。丰富的lncRNAs、EV mRNAs及其编码的核糖核蛋白之间的预测相互作用提示RNA-蛋白质模块的协调包装。总体而言，本研究验证了exoRNeasy适用于鱼类血浆，并提供了硬骨鱼中首个全面的长RNA EV图谱，为非模式鱼类的未来分子和功能研究提供了有价值的框架。

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是几乎所有细胞分泌的膜结合纳米颗粒，携带蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子，参与细胞间通讯。EV来源RNA（EV-RNA）在哺乳动物中已成为生物标志物来源，但在水生动物中研究仍处于早期。鱼类EV研究主要集中在小RNA，如微RNA（miRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）和蛋白质货物，长RNA尤其是信使RNA（messenger RNA, mRNA）和长非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）在硬骨鱼（teleosts）中的组成、稳定性和包装机制尚不清楚。前分析变量（pre-analytical variables）如输入血浆体积、储存温度、冻融循环和RNA分离方法可影响EV-RNA产量、完整性和组成，而鱼类血浆体积常低于2 mL，商业EV-RNA分离试剂盒在非哺乳类中缺乏独立验证。金头鲷（Sparus aurata）具有基因组资源、水产养殖重要性和环境生理敏感性，适合作为方法学验证模型。因此，研究人员评估exoRNeasy不同格式/体积和?20°C冷冻与新鲜处理对EV-RNA产量、组成及转录本完整性的影响，并用长读长测序表征mRNA和lncRNA货物。该研究验证了exoRNeasy可用于鱼血浆，并提供了首个硬骨鱼长RNA EV图谱，为未来分子和功能研究提供框架。

关键技术方法（不超过250字）：样本来自西班牙Santa Cruz de Tenerife的Canary Islands Oceanographic Centre（COC, IEO-CSIC）养殖金头鲷（Sparus aurata）13尾，采集全血并以EDTA抗凝，离心过滤获得血浆。关键方法包括：用exoRNeasy比较Maxi（约2 mL）与Midi（约1 mL）格式、Fresh与?20°C冷冻两周处理；以动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）进行EV质控；TapeStation评估RNA完整性和Short/Long比，Qubit定量；采用Oxford Nanopore Technologies（ONT）PCR-cDNA barcoding kit 24 v14建库、MinION Mk1C测序，经EPI2ME wf-transcriptomes流程和minimap2比对fSpaAur1.1；随机子抽样后以summarizeOverlaps计数，FLAIR和SQANTI3分析异构体，gprofiler2富集，RNAplex/IntaRNA及机器学习RNA-蛋白互作预测lncRNA-mRNA/RBP关系。

研究结果：3.1 EV Quality Control：DLS显示平均直径418.1 nm、主峰362.8 nm，多分散指数（PDI）0.428；TEM显示球形至椭圆形、边缘清晰、腔内较空的EV样结构，直径多小于200 nm，偶有轻度聚集，支持成功分离。3.2 RNA Integrity and Length Distribution：电泳显示低强度18S/28S rRNA峰和短转录本富集，约25和75 bp峰；Short/Long比大于1，提示EV-RNA特性且降解最小。3.3 Kit Format Comparison (Maxi Format vs. Midi Format)：3.3.1 RNA Integrity and Length Distribution：Maxi的28S/18S略高（p=0.1），Short/Long无显著差异，说明格式不影响RNA质量；RNA concentration, yield, and normalized yield：Maxi与Midi在浓度、产量和归一化产量上无显著差异，说明分离效率相当。3.4 Pre-processing Treatment Comparison (Fresh vs. Frozen Samples)：3.4.1 RNA Integrity and Length Distribution：28S/18S和Short/Long无显著差异，说明前处理不显著影响分离效率；3.4.2 RNA Concentration, Yield, and Normalized Yield：无显著差异，但Frozen浓度和总量略低（p=0.1），bootstrap置信区间0.080–0.194且p=0.498，提示?20°C两周影响小但不能排除细微影响；3.4.3 RNA Sequencing：Fresh和Frozen分别获得3,442,247和1,084,806条质控过滤读长，比对率86.59%和86.32%；子抽样至936,415条。平均读长Fresh为634.5±375.6，Frozen为606.5±368.9。Frozen短读更多、Fresh长读更多，Kolmogorov-Smirnov和卡方检验在100、250、500 bp分箱均显著；3.4.4 Genomic Characterization of EV Transcripts：mRNA为主，lncRNA次之，Frozen的sncRNA分布不同；lncRNA/mRNA比相似；sncRNA/mRNA在Frozen升高（8.75×10^?5 vs Fresh约2.55×10^?5–3.03×10^?5），lncRNA/sncRNA在Fresh更高（约1825.16–2196.52 vs 685.86）。mRNA映射10,230个蛋白编码基因，前50个占超过60%读数，约95%在两条件一致，85%为核糖体或核糖体相关蛋白；结果中lncRNA基因条目映射304个lncRNA基因，其中两个占近90%读数；3.4.5 Isoform Identification Analysis：Fresh异构体最多，全剪接匹配（FSM）最丰富，Fresh的FSM/不完整剪接匹配（ISM）高于Frozen，提示Frozen不完整异构体比例更高；3.5 Enrichment Analysis：mRNA的Gene Ontology（GO）富集于翻译、核糖体生物发生、rRNA加工、胞内/蛋白运输、自噬、RNA定位、造血、蛋白折叠等；lncRNA无功能注释，故分析两个最丰富lncRNA LOC115584152和LOC115578803与mRNA及RNA结合蛋白（RBP）互作，分别预测16和94个mRNA，40个蛋白与一个或两个lncRNA互作，提示RNA-蛋白模块协调包装。

讨论部分总结：研究人员认为，exoRNeasy首次在鱼血浆中验证，适用于低体积样本且兼容长读长测序；Maxi/Midi无差异，但Maxi为混合样本，故应解释为格式性能可比而非单纯体积等同。冷冻不显著改变总体RNA产量和主要生物类型/优势转录本，但显著影响读长分布和异构体完整性，Frozen更多短读和不完整异构体，提示长RNA选择性降解；高丰度EV货物稳定。功能上，EV mRNA富集核糖体与代谢mRNA，与脊椎动物保守EV特征一致；两个lncRNA占近90%，预测与mRNA和RBP互作，提示可能在转录调控、代谢适应和免疫信号中发挥作用。局限性包括样本量小、低RNA输入、poly(A)依赖偏倚、互作预测需验证、柱式分离可能共分离、Midi/Maxi比较非同一生物样本、基因组注释限制。未来需正交分离、更高深度和功能验证。

结论翻译：总体而言，新鲜和冷冻血浆样本的EV-RNA货物在很大程度上保守，RNA生物类型组成可比，最丰富转录本高度重叠。这表明冷冻未实质改变EV-RNA总体代表性。然而，在转录本水平观察到更细微差异，尤其在大小分布和异构体完整性方面，冷冻样本显示更高比例的不完整异构体和较短RNA种类的相对富集。因此，虽然冷冻为EV-RNA保存和总体转录组分析提供了可接受策略，适用于丰富RNA的生物标志物筛选或检测处理间主要差异，但其可能引入小偏差，在特定情境如低丰度长转录本（例如lncRNAs、全长mRNAs）或异构体水平分析中变得显著，此时降解可能扭曲全长与不完整异构体比例。这些结果强调比较性EV-RNA研究需一致的前处理和仔细控制储存条件。最后，本研究不仅确认S. aurata EV中存在lncRNAs，鉴定302个不同转录本，并证明所选方案适合lncRNA检测，还提供了通过预测未注释lncRNAs与mRNAs及其编码RNPs在EV内相互作用来探索其潜在生物学功能的框架。