氮添加下沼泽莎草 Schoenoplectus americanus 根际真菌群落响应随时间反映基因型与G × E变异而非可遗传性状变异

《Molecular Ecology》：Rhizosphere Fungal Community Responses to Nitrogen Addition Reflect Genotypic Versus Trait Variation in the Marsh Sedge Schoenoplectus americanus Over Time

　　

越来越多认识表明，变化的环境条件能够改变植物-微生物互作的性质及其潜在收益。尽管真菌互作在环境胁迫下有益于植物已被广泛证实，但关于植物暴露响应如何与可能塑造真菌群落的多种因素相对应，尤其是随时间变化，人们仍知之甚少。研究人员采用复活生态学（resurrection ecology）方法，考察了对比环境条件与基础性盐沼莎草 Schoenoplectus americanus 的种内变异对根际（rhizosphere）真菌群落的相对影响。由100年以上种子萌发的祖先植物队列与现代植物在低氮（N）和高氮浓度下于普通园（common-garden）实验中生长。根据植物存在以及基因型和相关性状变异对真菌群落进行表征。研究揭示，S. americanus 对真菌群落的影响在不同氮处理间存在差异。在低氮下，根际土壤中真菌分类学多样性高于未种植对照，但功能群（guild）多样性并非如此。然而，高氮条件下植物效应减弱。研究人员还发现，可遗传性状对真菌群落影响有限，而分类学与功能群多样性和组成均反映基因型变异及基因型×环境（G × E）互作。祖先和现代植物队列还依据氮条件招募了不同的真菌群落。这些结果表明，植物-真菌关联随时间的变化取决于当前主导环境条件。研究人员的发现还表明，氮驱动的植物-真菌互作变化可能改变对盐沼应对变化环境条件具有核心意义的生态系统过程。

研究背景与问题：环境条件变化可改变植物-微生物互作的性质和潜在收益。真菌互作在环境胁迫下有益于植物已较明确，但植物响应如何对应可能塑造真菌群落的因素，尤其随时间变化，仍了解不足。植物物种和种内变异均可影响根际微生物；基因型间性状差异可能改变根系资源与土壤条件；可遗传性状随时间的改变也可能影响植物与微生物互作。氮（N）富集可直接通过非生物过滤、也可经植物介导间接影响根际真菌。沿海盐沼受营养加载等环境胁迫，基础性植物 S. americanus 对氮富集敏感。研究人员因此检验：H1，植物存在是否在氮添加下改变真菌分类学与功能群多样性；H2a，真菌分类与功能变异是否由 S. americanus 基因型间性状变异驱动；H2b，祖先与现代后代基因型是否不同；H3，植物-真菌关联是否受基因型×环境（G × E）互作影响。

研究人员采用复活生态学（resurrection ecology，利用历史种子/样本研究时间变化）方法，将祖先生物（约100年种子，来自>16 cm深度）与现代后代（<4 cm）S. americanus 克隆置于温室普通园实验。实验包括含沼泽微生物的植物处理（P+）与无植物（P?）、两个氮水平（低氮：5 g m^?2 year^?1 NH₄Cl；高氮：25 g m^?2 year^?1 NH₄Cl），并设植物对照（P+M?）和微生物对照（P?M?），共228个中宇宙（mesocosm，实验装置），培养4个月。研究得出：S. americanus 影响真菌群落，且受氮条件调节；可遗传性状影响有限；真菌群落反映基因型变异和G × E互作；祖先与现代队列招募的真菌群落不同。意义在于，植物-真菌关联随时间动态变化，氮驱动的变化可能影响盐沼生态系统过程。

关键技术方法（≤250字）：样本队列来源为 Chesapeake Bay 的 Rhode River 河口 Corn Island marsh 时间分层种子库，种子用 ²¹⁰Pb 和 ¹³⁷Cs 放射性同位素定年；土壤接种取自 Texas Oso Bay near Corpus Christi 沼泽。方法包括温室普通园暴露实验，测量茎高、茎数、茎密度、茎直径、比叶面积、地上/地下生物量、根冠比（R:S）等植物性状；提取土壤DNA，扩增内转录间隔区（ITS）ITS2，Illumina MiSeq 2×250测序；QIIME 2 v.2024.2、DADA2生成扩增子序列变异（ASV），UNITE v.9分类，FUNGuild分配功能群；采用广义线性模型（GLM）、估计边际均值（EMM）、PERMANOVA、db-RDA、多模型推断、结构方程模型（SEM）、指示物种分析和广义线性混合模型（GLMM）。

研究结果：
3.1 Summary Statistics：获得228个土壤样本共5,112,386条真菌序列，归为4149个ASV。子囊菌门（Ascomycota）占78.5%，担子菌门（Basidiomycota）10.5%，Rozellomycota 2.2%，Aphelidiomycota 0.43%，壶菌门（Chytridiomycota）0.30%。纲水平 Sordariomycetes 最丰富，占60.2%，其次 Eurotiomycetes 9.8%、Agaricomycetes 9.8%、Pezizomycetes 3.7%、Dothideomycetes 2.3%。共64个功能群，前三位为动物病原–内生菌–植物腐生菌（animal pathogen–endophyte–plant saprotrophs）28.3%、外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungi）24.2%、未定义腐生菌（undefined saprotrophs）17.9%。

3.2 Plant Trait Variation：在含沼泽微生物的种植中宇宙（P+M+）中，高氮下 S. americanus 的根冠比（R:S）显著降低（β=?1.03，p=0.006）；现代基因型较祖先基因型 R:S 更低（β=?0.830，p=0.006）；氮×年龄队列交互不显著。高氮下比叶面积（SLA，β=0.60，p=0.036）和茎高（SH，β=0.37，p=0.031）显著较高，反映地上生长增加。

3.3 Overall Influence of Plant Presence on Soil Fungal Communities (H1)：植物存在显著增加真菌ASV多样性，种植土壤均值6.33±4.02，未种植土壤5.58±2.87（F_1,203=13.83，p<0.001），且植物×氮交互显著（F_1,203=5.74，p=0.017）。低氮下根际土壤高于 bulk soil（6.31±0.46 vs 3.83±0.32，p<0.001）；高氮下有无植物无差异（t=?1.44，p=0.151）。根际内低氮高于高氮（t=2.05，p=0.042）。沼泽微生物处理强烈影响真菌ENSpie多样性（F_1,203=124.86，p<0.001）。β多样性中，植物存在、氮输入、沼泽微生物均显著，植物×微生物和氮×微生物互作显著，植物×氮不显著。功能群水平上，植物存在对功能群α多样性影响不显著（F_1,201=0.10，p=0.751），氮输入不显著（F_1,201=2.02，p=0.157），沼泽微生物显著（F_1,201=48.22，p<0.001）；功能群组成受植物、氮、微生物及其互作影响，三因素互作显著（F_1,203=2.87，p=0.028）。

3.4 Influence of Intraspecific S. americanus Trait Variations on Rhizosphere Fungi Across Age Cohorts (H2)：多模型推断显示，沼泽微生物处理造成最大差异（β=0.65±0.12，p<0.001）；高氮降低ASV多样性（β=?0.26±0.12，p=0.029）。茎直径、茎数、R:S、地下生物量、SLA相对重要性低（Σw≤0.44）。年龄队列对ASV多样性不显著（Σw=0.27；β=?0.11±0.11，p=0.32）。群落组成随年龄队列、沼泽微生物和氮处理变化；PERMANOVA中，氮与沼泽微生物处理交互显著（R²=0.014，F_1,94=1.87，p=0.039），祖先与现代基因型间差异显著（R²=0.014，F_1,94=1.83，p=0.047）。指示物种分析中，2个ASV与祖先关联，16个ASV与现代关联；ASV_2136（Ascomycota; Pezizomycetes; Pezizales sp.）与祖先独特关联，ASV_1358（Ascomycota; Sordariomycetes; Zopfiella sp.）与现代强烈关联。db-RDA显示氮输入和年龄队列显著贡献ASV组成变异。SEM显示氮直接负影响ASV ENSpie（estimate=?0.236，p=0.041），沼泽微生物正影响（0.673，p<0.001），年龄队列影响有限；氮影响R:S，但R:S不影响真菌多样性。功能群水平上，年龄队列显著负效应（β=?0.16±0.07，p=0.015，Σw=0.86），现代低于祖先；功能群组成仅年龄队列差异显著（F_1,94=3.06，p=0.019）。指示功能群中，6个功能群与低氮关联，2个与高氮关联；3个功能群在低氮下与祖先强烈关联，而现代植物在高氮下富集一个特化苔藓寄生虫/植物腐生菌/木材腐生菌功能群复合体。

3.5 Differences in Rhizosphere Soil Fungal Communities Reflect G × E (H3)：BLUP估计显示基因型特异性氮响应，幅度和方向依赖沼泽微生物存在。祖先基因型A11和A5对比明显；P+M+下ASV多样性的基因型变异范围大于P+M?。功能群多样性模式不同：沼泽微生物存在下基因型特异性氮响应较弱，微生物对照下较强且较一致。

讨论总结：4.1 植物存在对沼泽土壤真菌的影响取决于氮水平。低氮下 S. americanus 提高ASV多样性但不提高功能群多样性，功能群组成仍不同，可能因植物提供碳源并改变氮有效性；高氮下植物影响减弱，可能因氮直接选择特定真菌、改变根际沉积，降低真菌对植物资源依赖。4.2 根际真菌群落反映G × E而非可遗传性状变异。植物性状对氮有响应，但未延伸至真菌多样性或组成，SEM亦未发现性状介导的间接影响。G × E表明关联可塑且基因型间不同；高氮降低变异；有沼泽微生物池时基因型效应更明显，提示根际群落可为扩展根表型。4.3 祖先与现代基因型真菌关联不同，现代功能群α多样性较低但指示类群更多，表明真菌招募随时间/代际动态变化。4.4 Conclusion翻译：研究人员的研究表明，植物进化以及植物与真菌之间的生态互作，可能是塑造沿海生态系统在营养富集等人为压力下持续存在的重要因素。由于 S. americanus 是沿海盐沼的优势种和生态系统工程师，其真菌共生体的变化可能改变关键沿海生态系统过程。例如，真菌群落组成变化可能影响有机质分解和氮转化，因为盐沼真菌参与植物凋落物分解并参与反硝化过程。研究人员的结果还表明，植物-真菌关联是动态的（即随时间变化），并且植物影响其关联真菌群落的程度可能被强烈环境扰动削弱。理解植物与微生物之间的功能联系、这些联系在环境变化下如何转变，以及功能转变如何塑造生态系统过程，可能改善对处于风险中的沿海盐沼生态系统近期未来和长期命运预测的努力。