水生样品中环境RNA（eRNA）保存与提取的实用且成本有效方法学：面向emRNA与eDNA共提取

《Molecular Ecology Resources》：Establishing Practical and Cost-Effective Methodologies for Preservation and Extraction of Environmental RNA (eRNA) From Aquatic Samples

　　

在水生系统中采样环境核酸（environmental nucleic acids，包括环境DNA（environmental DNA，eDNA）与环境RNA（environmental RNA，eRNA），合称eNA）有助于高效探索水生物种分布。由于eRNA本质上比eDNA更不稳定，eRNA可能提供关于生物体更精细的时空信息，但这种易变性也带来独特方法学挑战，使得eDNA方案是否适用于eRNA样品尚不清楚。为弥补这一空白，研究人员利用来自大口黑鲈（Micropterus salmoides）线粒体细胞色素b（CytB）基因的天然eRNA和eDNA，以及从蓝鳃（Lepomis megalotis）组织提取的DNA和RNA开展实验。研究人员首先进行降解实验，以检验冷藏对eRNA保存（特别是线粒体信使eRNA，mitochondrial messenger eRNA，emRNA）的效果，因为冷藏广泛用于eDNA样品。随后，研究人员在实验室比较了一系列用于emRNA和eDNA长期保存与共提取的方法。尽管eRNA的不稳定性可能使eDNA方法不适用，但研究人员发现，为eDNA样品开发的方法可方便地重新用于emRNA。与研究人员的假设相反，即水样冷藏可能无法在短期内有效保存emRNA，置于冰上冷却箱中的样品在25 h内对大口黑鲈未显示浓度或可检测性下降（Tukey's，所有p > 0.3）。过滤时间（即在室温下花费的时间）也略微降低eRNA产量，大口黑鲈emRNA浓度随过滤时间增加而降低（线性模型，linear model，LM，p = 0.05），凸显整个过程保持低温的重要性。此外，如研究人员假设，低成本氯仿提取方案对大口黑鲈和蓝鳃产生的emRNA数量与更昂贵商业试剂盒相当（Tukey's，方法间p > 0.8），在某些情况下甚至高于这些方法。总体而言，这些结果证明了eRNA采样的实际可行性，并为自然系统中eRNA的未来工作提供指导。

论文解读：水生样品中环境RNA（eRNA）保存与提取的实用且成本有效方法学

水生系统中采样环境核酸（environmental nucleic acids，eNA），包括环境DNA（environmental DNA，eDNA）和环境RNA（environmental RNA，eRNA），可高效探索水生物种分布。传统采样对低密度物种、濒危物种和新引入入侵种常难以检测，eDNA因准确和成本有效被广泛用于监测与管理。但eRNA研究较少。RNA单链性质、羟基和高活性RNases使其不稳定，曾认为水中RNA会快速降解而无法采集；近期研究表明eRNA在水体中丰富，且其快速降解可能提供比eDNA更精确的时空和种群信息。线粒体看家基因的emRNA与鱼类生物量和丰度关系更强；eRNA因与基因表达关联，可用于生活史、产卵、毒理或应激检测。然而，eRNA采集、保存和提取方法信息缺乏，尤其现场短时保存是否可行、eDNA协议是否适用于eRNA、商业试剂盒与低成本氯仿法如何比较尚不清楚。因此，研究人员开展研究，评估自然水体中emRNA和eDNA的保存与共提取方法。结论表明，为eDNA开发的方法可方便地重新用于emRNA；冰上短期冷藏25 h未见天然大口黑鲈emRNA浓度或可检测性下降；过滤时间增加略降低天然emRNA；低成本氯仿提取与昂贵商业试剂盒产量相当甚至更高。该研究证明eRNA采样具有实际可行性，为自然系统eRNA工作提供方法学指导。

关键方法概括：样本来自Jake Wolf Memorial Fish Hatchery（Topeka, IL）一个1893 m³鱼种池，约400–500尾大口黑鲈（Micropterus salmoides）。采集1 L水样，分5批，每批含各时间点或处理一重复。蓝鳃（Lepomis megalotis）组织DNA/RNA作为过滤后spike-in和阳性质控。水样过滤于1.2-μm混合纤维素酯（mixed cellulose ester，MCE）滤膜；滤膜保存于DNA/RNA Shield、RNAlater、十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）缓冲液或无缓冲干式冷冻。提取比较Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini、Zymo Quick-DNA/RNA Miniprep Plus与氯仿:异戊醇法。RNA经DNase（deoxyribonuclease，脱氧核糖核酸酶）处理，SuperScript IV逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），使用Oligo d(T)₂₀和随机六聚体；定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）双工检测大口黑鲈和蓝鳃线粒体细胞色素b（mitochondrial cytochrome b，CytB）。统计用R线性模型和Tukey's检验。

结果：
3.1 实验A：冰上现场保存（Field Preservation on Ice）。水样采集后置于冰上冷却箱，分别在0、0.5、2、5、10和25 h过滤。天然大口黑鲈emRNA和eDNA浓度在时间点间无显著差异（Tukey's，所有p > 0.3），表明冰上放置后未检测到eNA明显降解。大口黑鲈emRNA许多样品低于定量限（limit of quantification，LOQ）但高于检测限（limit of detection，LOD），且检测性未随时间下降。蓝鳃spike-in eDNA各时间点无差异；蓝鳃emRNA在0 h高于后续所有时间点（p < 0.05），0.5–25 h无差异；线性回归未发现蓝鳃或大口黑鲈emRNA/eDNA随时间显著衰减（p > 0.2）。结论：冰上冷藏可支持eRNA短期现场保存；自由spike-in emRNA可能更易受过滤后处理差异影响。

3.2 实验B：保存与提取方法（Preservation and Extraction Methods）。处理代码中，Dr=干式、Ct=CTAB、Sh=DNA/RNA Shield、Lt=RNAlater；Qb=Qiagen裂解缓冲液；Ch=氯仿、Zy=Zymo、Qi=Qiagen试剂盒。RNAlater保存后CTAB裂解加氯仿提取（Lt-Ct-Ch）未见可测量DNA和RNA扩增，故排除。天然大口黑鲈emRNA最高产量为干式冷冻后CTAB裂解加氯仿提取（Dr-Ct-Ch）和干式冷冻后Qiagen裂解/提取（Dr-Qb-Qi），显著高于多数方法；RNAlater保存后Qiagen提取（Lt-Qb-Qi）和CTAB保存/裂解后氯仿提取（Ct-Ct-Ch）也同等有效。天然大口黑鲈eDNA也以Dr-Ct-Ch和Dr-Qb-Qi较高，与Ct-Ct-Ch、Dr-Sh-Ch相当。蓝鳃spike-in emRNA最高为Ct-Ct-Ch、Sh-Sh-Zy和Sh-Sh-Ch；蓝鳃eDNA最高为Ct-Ct-Ch和Sh-Sh-Ch。过滤时间增加与天然大口黑鲈emRNA浓度略降低相关（LM，p = 0.05），但对蓝鳃emRNA、大口黑鲈eDNA和蓝鳃eDNA无影响。结论：氯仿法对emRNA可与商业试剂盒相当或更高；天然核酸与自由spike-in最佳方法不同，提示eRNA存在状态影响方法选择。

讨论部分认为，eDNA保存和提取方法经微调可用于emRNA。冰上25 h未见天然emRNA实质降解，但过滤时室温时间增加可能降低天然emRNA，强调全程低温。氯仿法与Qiagen kit相当且成本更低（Qiagen $15.94、Zymo $9.31、氯仿 $1.21），但需通风柜和更多危险废物；Qiagen若加β-巯基乙醇也可能需通风柜。RNAlater+CTAB+氯仿失败可能因RNAlater残留含EDTA（乙二胺四乙酸）和柠檬酸钠等PCR抑制剂。干式冷冻高产出乎意料，但效果不一致，需进一步验证。不同状态eRNA（膜保护或自由链）适合不同方法。局限包括仅单物种单地点，未设室温对照，需更多分类群和地点验证。

结论部分翻译：在本研究中，研究人员测试了emRNA和eDNA保存与共提取的各种方法，发现为eDNA样品开发的方法，如短期冷藏和氯仿提取，可重新用于处理来自水生样品的eRNA。总体而言，这些结果证明了在实验室环境之外进行eRNA采样的后勤可行性，并为自然系统中eRNA工作和未来方法学进展提供了基础信息。随着领域发展，进一步优化eRNA处理方法将有益于增强其作为从生物体收集时空和种群统计学数据用于研究、监测和管理的工具。未来工作可在上述结果基础上，通过测试不同栖息地的更多物种，并探索提高eRNA提取产量的方法，如优化缓冲液体积、裂解时间和裂解温度。未来研究还可致力于表征eRNA状态，并相应靶向保存和提取方法，如同对eDNA所做。尽管对eRNA方法学的理解仍落后于eDNA，本研究结果是将eRNA采样确立为可行分子工具的重要一步。