整合转录组与染色质可及性分析鉴定冬油菜（Brassica rapa L.）低温应答候选调控网络

《Plant Physiology and Biochemistry》：Integrated transcriptomic and chromatin accessibility analyses identify candidate regulatory networks associated with cold responses in Winter Rapeseed ( Brassica rapa L.)

低温胁迫是限制油菜（Brassica rapa）生长、发育、区域适应性和产量稳定性的主要非生物胁迫。为探究不同耐寒性油菜品种在低温下的转录重编程与染色质可及性动态变化，研究人员选取耐寒品种L7（龙油-7）和冷敏感品种Lenox，在0°C处理24小时后对茎尖进行RNA测序（RNA-seq）和转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）。结果表明，L7表现出更轻的表型损伤和更强的抗氧化防御与渗透调节能力。RNA-seq共鉴定出L7中6828个差异表达基因（DEGs），Lenox中5824个DEGs，L7展现出更广泛的低温响应转录重编程。ATAC-seq分析发现，低温诱导了显著的染色质可及性重塑，L7中检测到10731个差异可及区（DARs），多于Lenox的9414个。整合多组学分析将DAR关联基因与主要的低温应答通路联系起来，包括MAPK信号转导、谷胱甘肽代谢、苯丙烷类和类黄酮生物合成、淀粉与蔗糖代谢以及昼夜节律。基序富集分析进一步优先筛选出ERF、WRKY、MYB、NAC、bHLH和bZIP等转录因子家族作为候选调控因子。基于此构建的候选调控网络包含1265个转录因子与2303个潜在靶基因。综上，L7的低温耐受性可能由协调的表观基因组-转录组调控、抗氧化防御和渗透稳态共同驱动，为油菜耐寒性分子育种提供了候选靶标。

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一、研究背景与科学问题

低温胁迫是制约全球油菜（Brassica rapa）生长发育、区域适应性及产量稳定性的主要非生物逆境之一。油菜在苗期、越冬期、抽薹期、开花期和结实期均可能遭受低温伤害，导致细胞膜系统稳定性下降、膜脂过氧化加剧、活性氧（ROS）过量积累以及光合作用受抑，同时能量代谢、渗透调节和抗氧化防御过程被扰乱，最终抑制植株生长并造成产量损失。尽管已有大量转录组学研究揭示了低温应答的差异表达基因（DEGs），但单一转录组分析难以解释为何特定应答基因被激活或抑制，也无法全面阐明顺式调控元件激活、转录因子招募及染色质结构重塑在基因表达调控中的作用。因此，亟待系统解析不同耐寒性油菜品种在低温胁迫下染色质可及性的动态变化及其与转录重编程的耦合关系，并鉴定关键转录因子及其顺式作用元件，从而构建表观基因组-转录调控网络，为耐寒分子育种提供理论依据和候选靶标。

二、主要技术方法

本研究选用耐寒品种L7（龙油-7）和冷敏感品种Lenox，于人工气候室培养至三至五叶期后，在0°C处理24小时采集茎尖样品，并以正常生长条件（28°C/16°C昼/夜温度）的幼苗为对照。分别采用RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000平台，双端150 bp测序）和ATAC-seq（Tn5转座酶介导的文库构建与测序）获取转录组和染色质可及性数据。利用DESeq2鉴定DEGs（|log₂Fold Change|≥1，校正P<0.05），MACS2进行ATAC-seq峰值检出，DiffBind鉴定DARs（相同阈值），并通过MEME Suite进行基序富集分析。整合RNA-seq与ATAC-seq数据，将DAR关联基因与DEGs取交集，结合基序富集与转录因子表达变化构建候选调控网络。

三、研究结果

1. L7与Lenox在低温胁迫下表型与生理差异

在0°C处理24小时后，Lenox叶片明显萎蔫下垂，而L7保持相对正常的形态，复温后L7恢复更显著。生理测定显示，L7在处理期间表现出更高的过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性，并积累更多的可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白；而Lenox则积累了更高水平的超氧阴离子和丙二醛（MDA），表明其ROS清除能力较弱、膜脂过氧化损伤更严重。

2. 低温应答差异表达基因分析

RNA-seq共鉴定出L7中6828个DEGs（2660个上调、4168个下调），Lenox中5824个DEGs（2228个上调、3596个下调）。维恩分析显示两者共享2536个低温响应DEGs，而L7特有4292个、Lenox特有3288个，表明L7启动了更广泛的特异性转录响应。表达模式聚类将DEGs分为四个簇，其中Cluster 2基因主要在L7低温处理后诱导上调，显著富集于昼夜节律、MAPK信号转导、谷胱甘肽代谢、类黄酮生物合成和细胞色素P450等通路。共享DEGs则主要富集于植物激素信号转导、核糖体生物发生、谷胱甘肽代谢、苯丙烷生物合成和α-亚麻酸代谢等过程。

3. 基因型特异性差异表达特征

比较两品种在对照和低温条件下的DEGs，发现L7与Lenox存在大量基础转录差异，低温处理进一步放大了这种分歧。L7低温诱导的Cluster 2基因（在L7中显著上调而在Lenox中低表达）富集于昼夜节律、MAPK信号、精氨酸与脯氨酸代谢、氨酰-tRNA生物合成和细胞色素P450等通路，暗示L7通过强化信号转导、渗透调节和翻译稳态增强低温适应。

4. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）

基于所有DEGs的表达矩阵构建加权基因共表达网络，将基因划分为11个模块。模块-性状相关性分析显示，红色模块与POD、CAT、SOD、APX活性及可溶性糖、脯氨酸含量显著正相关，主要富集于昼夜节律、谷胱甘肽代谢、MAPK信号和精氨酸与脯氨酸代谢，被视为低温适应的核心正调控模块。黑色模块与SOD、脯氨酸、APX及超氧阴离子、MDA强相关，参与蛋白质稳态和能量代谢重塑。青色模块与多数生理指标负相关，代表受低温抑制的生长与光合相关基因群。从这三个模块中共鉴定出15个高度连接的候选枢纽基因，涉及冷刺激响应、ABA介导的胁迫信号、渗透与脱水胁迫应答、氧化胁迫防御和膜脂重塑等过程。

5. 低温诱导染色质可及性重塑

ATAC-seq分析显示，所有样品的ATAC-seq信号均在转录起始位点（TSS）附近清晰富集，且启动子区域是主要富集区。低温处理诱导了显著的染色质可及性变化：L7中检测到10731个DARs，Lenox中检测到9414个DARs，表明L7具有更强的动态染色质响应。品种间比较发现，低温处理后L7与Lenox间的DAR关联基因数量最多（17287个），说明低温进一步放大了两者间的染色质可及性差异。共享DAR关联基因显著富集于倍半萜和三萜生物合成、半乳糖代谢、磷酸戊糖途径、脂质代谢和甘油磷脂代谢等通路。

6. 整合RNA-seq与ATAC-seq分析

在L7中，613个上调DEGs和1068个下调DEGs与DARs相关联，这些基因分别富集于半乳糖代谢、氮代谢、磷脂酰肌醇信号系统和昼夜节律（上调），以及植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成、淀粉与蔗糖代谢和苯丙烷生物合成（下调）。在Lenox中，429个上调DEGs和802个下调DEGs与DARs重叠，上调基因富集于核糖体生物发生、类黄酮生物合成和昼夜节律，下调基因富集于MAPK信号、植物激素信号转导和苯丙烷生物合成。整体而言，RNA-seq与ATAC-seq共捕获9289个共有基因，这些基因显著富集于转运蛋白、苯丙烷生物合成、植物-病原互作、淀粉与蔗糖代谢、昼夜节律、MAPK信号和类黄酮生物合成等通路。

7. 表观基因组-转录组调控网络构建

DARs中的基序富集分析鉴定出多个胁迫响应转录因子结合基序，包括ERF、WRKY、bHLH、bZIP、GATA、ARF、NAC、MYB和TCP家族。基于基序富集、差异表达转录因子及DAR关联基因构建的候选调控网络包含1265个转录因子与2303个潜在靶基因，其中ERF、MYB、WRKY、NAC、bHLH和bZIP家族被优先视为协调低温信号转导、抗氧化防御、渗透调节和次生代谢重塑的关键候选调控因子。

四、讨论与结论

讨论部分指出，L7较低的氧化损伤更可能是ROS清除、碳水化合物代谢和渗透保护协同响应的结果，而非单一抗氧化组分的效应。低温响应不应仅依据DEG数量评估，而应关注重组的功能模块及其与胁迫表型的关联——L7的响应以MAPK信号、谷胱甘肽代谢和防御性次生代谢为代表，而Lenox的响应更多体现为蛋白质质量控制与基础代谢的重建。WGCNA鉴定的枢纽基因为候选基因优先排序提供了合理依据。在染色质层面，L7中更多的DARs反映了更多低温响应位点进入了潜在的可调控染色质状态，但DAR数目本身不能直接等同于耐寒性。基序富集仅指示潜在的转录因子识别序列，功能结局强烈依赖于基因组和顺式调控环境。研究强调，由于仅分析了单一时间点（24小时），无法确定DAR出现在基因表达变化之前、同时还是之后；L7与Lenox遗传背景差异也意味着某些基线差异可能反映品种特异性调控变异而非耐寒性的因果决定因素。未来应优先选择同时具备L7特异性表达响应、启动子DAR关联、显著TF基序富集和高网络连接度的候选调控因子，通过过表达、基因沉默或基因编辑进行功能验证。

结论翻译：本研究表明，在0°C胁迫下，耐寒品种L7比Lenox表现出更轻的表型损伤和更强的抗氧化防御与渗透调节能力。整合RNA-seq与ATAC-seq分析揭示，L7展现出更广泛的转录重编程和染色质可及性重塑，相关基因主要富集于MAPK信号转导、谷胱甘肽代谢、苯丙烷和类黄酮生物合成、淀粉与蔗糖代谢以及昼夜节律等通路。ERF、WRKY、MYB、NAC、bHLH和bZIP等转录因子可能在低温耐受调控网络中占据中心位置。这些候选转录因子及其预测的调控关系需要通过遗传操作（如低温胁迫下的过表达、基因沉默或基因编辑）进行进一步功能验证。综上所述，L7的低温耐受性可能由协调的表观基因组-转录组调控、抗氧化防御和渗透稳态共同驱动，为油菜耐寒性分子育种提供了候选靶标。