《Plant Physiology and Biochemistry》：Dynamic transcriptomic profiling of
Salix triandra under freezing stress identifies
StWRKY31 as a positive regulator of cold tolerance
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低温胁迫，特别是冻融温度，严重限制了植物的生长、发育和地理分布。植物通过膜受体感知低温信号，触发一系列级联事件，包括钙离子（Ca2+）内流、活性氧（ROS）信号传导及蛋白激酶激活，最终引发广泛的代谢重编程，实现膜脂组成调整、渗透保护物质（如脯氨酸）积累及抗氧化
低温胁迫，特别是冻融温度，严重限制了植物的生长、发育和地理分布。植物通过膜受体感知低温信号，触发一系列级联事件，包括钙离子（Ca2+）内流、活性氧（ROS）信号传导及蛋白激酶激活，最终引发广泛的代谢重编程，实现膜脂组成调整、渗透保护物质（如脯氨酸）积累及抗氧化能力增强等生理适应。在分子层面，ICE-CBF-COR（CBF表达诱导因子–C重复结合因子–冷响应）级联通路在冷驯化中发挥核心作用，同时多种其他转录因子（TF）也通过复杂的共表达网络参与耐寒性调控。
三蕊柳（Salix triandra）是一种快速生长的多年生木本植物，天然适应亚零度冬季温度，表现出卓越的冻融耐受性。研究人员对三蕊柳在持续冻融条件下进行了时间序列转录组分析，通过差异表达和共表达网络分析，鉴定出一个冷诱导候选基因——WRKY转录因子StWRKY31，该基因在晚期响应共表达簇中呈现同步表达。研究人员进一步验证了StWRKY31的亚细胞定位，并构建了过表达StWRKY31的拟南芥（Arabidopsis thaliana）株系，以评估其对冻融耐受性、ROS积累、抗氧化酶活性及膜完整性的影响。研究结果为理解三蕊柳天然耐寒性的调控机制提供了见解，并为培育抗逆工业作物提供了潜在的遗传靶点。
论文解读
一、研究背景与科学问题
低温胁迫，尤其是冻融温度，是限制植物生长、发育和地理分布的重要环境因素。植物在感知低温信号后，通过膜受体触发钙离子内流、活性氧信号传导和蛋白激酶激活等一系列级联事件，最终导致广泛的代谢重编程，包括膜脂组成调整、渗透保护物质积累和抗氧化能力增强等生理适应。在分子层面，ICE-CBF-COR级联通路已被证实在冷驯化中发挥核心作用，同时MYB、bZIP等多种转录因子也通过物种特异性的共表达网络参与耐寒性调控。
三蕊柳是一种快速生长的多年生木本植物，原产于温带和寒冷地区，主要用于生物质生产、生物能源和植物修复。在中国，三蕊柳主要分布于东北各省。由于其天然适应亚零度冬季温度，三蕊柳表现出卓越的冻融耐受性，能够在极端低温胁迫下维持细胞活力。因此，三蕊柳不仅是重要的工业作物，也是鉴定冷响应基因、为改良其他经济重要物种冻融耐受性提供遗传资源的理想模式植物。然而，三蕊柳耐寒性的分子机制尚不清楚，亟需系统研究。
二、研究内容与主要结论
为探究三蕊柳冻融耐受性的分子基础，研究人员对其在持续冻融条件下进行了时间序列转录组分析，并通过差异表达和共表达网络分析鉴定出WRKY转录因子StWRKY31作为冷诱导候选基因。通过亚细胞定位分析和在拟南芥中过表达StWRKY31的功能验证，研究人员揭示了StWRKY31通过促进酶促和非酶促抗氧化防御增强冻融耐受性的调控机制。该研究为理解三蕊柳天然耐寒性的调控机制提供了新见解，并为培育抗逆工业作物提供了潜在的遗传靶点。
三、关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：以三蕊柳种质为材料，其采集自中国黑龙江省帽儿山国家森林公园，保存于南京林业大学白马教学科研基地，选取约20厘米高的均一幼苗在–4°C下分别处理0、4、12、24和48小时进行冻融胁迫；利用DNBSEQ-T7平台进行转录组测序，通过HISAT2比对、DESeq2差异表达分析、GO和KEGG富集分析解析转录组动态变化；采用Pearson相关系数进行基因中心共表达网络分析，以r>0.95且P<0.05为阈值构建高置信度共表达网络；通过农杆菌介导的花序浸蘸法将StWRKY31过表达载体转入野生型拟南芥Col-0，获得纯合T3代转基因株系；利用qRT-PCR验证转录组数据并检测转基因株系中基因表达水平；通过GFP融合蛋白的瞬时表达和激光共聚焦显微镜观察进行亚细胞定位分析；通过DAB和NBT组织化学染色以及商业试剂盒测定SOD、POD活性及MDA、脯氨酸含量进行生理学分析。
四、研究结果
3.1 冻融胁迫下三蕊柳的生理响应与全局转录组重编程
三蕊柳幼苗在–4°C处理0至48小时期间，幼叶未出现可见冻害症状，保持膨压和绿色。脯氨酸含量及SOD和POD活性均显著升高，确认了活跃的生理响应。转录组测序共获得141.61 GB的清洁数据。主成分分析显示基因表达谱沿PC1轴呈现清晰的时间进程，生物学重复紧密聚类。差异表达分析鉴定出大量转录重编程：差异表达基因（DEGs）数量从4小时的841个急剧增加至48小时的9,163个。基于表达谱聚类分析鉴定出6个共表达簇，其中簇1、2、4主要呈下调模式，反映代谢调整和生长停滞；簇6呈快速瞬时诱导模式，于4小时达峰，包含早期响应胁迫传感器、信号转导组分和初级转录因子；簇5和簇3呈延迟但持续诱导模式，分别于24小时和48小时达峰，可能编码冷冻保护剂、渗透调节物质和ROS清除剂。
3.2 共表达簇的功能特征分析
GO和KEGG富集分析揭示了各共表达簇的功能特征。下调的簇1富集于光合作用相关组分，KEGG分析确认了“光合作用”“碳代谢”和“乙醛酸和二羧酸代谢”的抑制；簇2富集于“生长素受体活性”，KEGG揭示“油菜素甾醇生物合成”和“脂肪酸延长”受抑制；簇4富集于“多糖结合”及“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解”和“萜类骨架生物合成”通路。早期诱导的簇6与乙烯信号、硫化合物转运和线粒体转运相关，KEGG分析富集于“MAPK信号通路”。晚期诱导的簇3与核糖体生物发生和RNA加工相关；簇5富集于多种胁迫响应和调控过程，包括花青素生物合成、昼夜节律和激素响应，是唯一显著富集“冷响应”的簇，KEGG分析显示富集于“硫代谢”和“核黄素代谢”两个冻融耐受相关通路。
3.3 冷响应转录因子的鉴定与RNA-seq数据验证
利用PlantTFDB数据库共鉴定出875个差异表达转录因子，属于52个家族。其中六个家族各占差异表达转录因子的5%以上：ERF（85个）、bHLH（70个）、MYB（62个）、NAC（62个）、bZIP（53个）和WRKY（46个）。层次聚类显示不同家族呈现不同的时间表达模式。选取8个代表性冷响应DEGs进行qRT-PCR验证，Spearman秩相关分析显示两组数据间呈强正相关（ρ=0.950，P<0.001），确认了转录组数据的可靠性。
3.4 潜在参与冻融耐受性的StWRKY31的鉴定
通过同源BLASTP搜索，以8个已知抗冻蛋白（AFP）为查询序列，在三蕊柳蛋白质组中鉴定出80个同源序列，与11,287个DEGs取交集后获得29个差异表达的冷响应基因。层次聚类将其分为4个簇，其中27个基因属于WRKY家族。EVM0008367（命名为StWRKY31）在簇C中表达最为突出，于24小时达到峰值（15.75倍）。亚细胞定位分析表明StWRKY31-GFP融合蛋白特异定位于细胞核，与DAPI染色共定位，符合其作为转录因子的预期功能。
3.5 StWRKY31增强拟南芥冻融耐受性
获得9个独立的卡那霉素抗性转基因株系，选取表达量最高的OE3、OE6和OE10三个纯合T3代株系进行冻融耐受性分析。正常生长条件下，野生型（WT）与过表达株系无显著表型差异。在冷驯化冻融试验中，StWRKY31-OE株系存活率为75.0%–88.3%，显著高于WT的34.5%；在非驯化条件下，OE株系存活率（63.9%–77.8%）也显著高于WT（16.7%）。冻融处理后，OE株系中SOD和POD活性及脯氨酸含量显著高于WT，而MDA积累显著低于WT，表明StWRKY31通过增强抗氧化能力和渗透调节减少膜损伤。
3.6 StWRKY31改变转基因拟南芥中冷响应标记基因的表达
基因中心共表达分析鉴定出80个与StWRKY31高度正相关（r>0.95，P<0.05）的基因，其中包含两个谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因。基于此，研究人员检测了拟南芥中AtGSTF8、AtHY5和AtZAT10三个冷响应标记基因的表达。在冷暴露前（0小时），三个基因在StWRKY31-OE株系中的基础表达均显著高于WT，其中AtZAT10上调约10倍，AtGSTF8和AtHY5约3倍。冷暴露后1小时和3小时，这些基因在OE株系中仍保持显著较高表达。至6小时，AtHY5在OE株系中维持显著较高表达，而AtGSTF8和AtZAT10降至低于WT水平。结果表明StWRKY31不仅增强特定冷响应基因的基础表达，还调节其在冷胁迫期间的动态表达模式。
五、讨论与结论
讨论部分指出，与草本植物中CBF快速响应（2–6小时达峰）不同，多年生木本植物在长期冻融胁迫中表现出更复杂和持续的调控模式。三蕊柳的多相转录响应包括早期胁迫感知（簇6，4小时达峰）、随后的代谢调整和持续细胞保护（簇5和簇3，分别于24小时和48小时达峰），反映了“生长-防御权衡”下的能量重新分配。StWRKY31在–4°C冻融胁迫下于24小时达峰的表达模式，区别于许多草本物种中观察到的快速转录爆发，提示其可能调节长期细胞稳态而非即时冷感知。StWRKY31通过促进酶促（SOD/POD）和非酶促（GSH相关）抗氧化防御增强冻融耐受性，其相关共表达簇显著富集于硫代谢通路，该通路对谷胱甘肽生物合成至关重要。StWRKY31还调节AtGSTF8、AtZAT10和AtHY5等冷响应标记基因的表达，这些基因在冷暴露前即呈现升高的基础表达，提示可能存在防御预启动状态。研究也承认了异源拟南芥系统的局限性，指出三蕊柳稳定遗传转化体系尚未建立，未来建立高效转化系统对于最终验证StWRKY31的体内功能至关重要。
结论部分总结：本研究通过对三蕊柳在冻融胁迫下的时间序列转录组分析，鉴定出StWRKY31作为属于中晚期适应模块的冷诱导转录因子。在拟南芥中过表达StWRKY31显著增强了冻融耐受性，表现为存活率提高、ROS积累减少、抗氧化酶活性和脯氨酸含量增加以及MDA积累减少。此外，StWRKY31以时间依赖性方式调节冷响应标记基因（AtGSTF8、AtZAT10和AtHY5）的表达。综合这些发现表明，StWRKY31作为冻融耐受性的正向调控因子，至少部分通过增强酶促和非酶促抗氧化防御发挥作用。
