《Plant Direct》：Validation of a Modular Base Editing Strategy, Free-BE, in Physcomitrium patens, Maize, and Wheat
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碱基编辑（base editing, BE）技术能够实现精确的基因组修饰，但常常产生非预期的编辑结果，包括插入缺失（indels）、旁观者编辑（bystander edits）以及在最佳活性窗口之外的编辑。本文报道了一种模块化BE策略，称为Free-BE，其中
碱基编辑（base editing, BE）技术能够实现精确的基因组修饰，但常常产生非预期的编辑结果，包括插入缺失（indels）、旁观者编辑（bystander edits）以及在最佳活性窗口之外的编辑。本文报道了一种模块化BE策略，称为Free-BE，其中胞嘧啶脱氨酶与Cas9切口酶以独立组分形式递送，而非融合为单一融合蛋白。在小立碗藓（Physcomitrium patens）中，Free-BE的编辑效率低于常规融合系统（Fused-BE），但产生的indels更少、单核苷酸编辑比例更高，并且窗口外编辑减少。Free-BE还改变了碱基替换谱，与Fused-BE相比，在小立碗藓中产生了更高比例的C-to-G和C-to-A颠换。在检测的四个预测脱靶位点中均未检测到突变。研究人员进一步在作物系统中验证了Free-BE：在玉米原生质体瞬时报告实验中，Free-BE实现了靶向碱基转换；而小麦稳定转化则证明其能够成功编辑内源位点，尽管效率低于Fused-BE。在小麦中，Free-BE同样减少了多胞嘧啶编辑和副产物。综上所述，这些结果确立了Free-BE作为一种功能性的模块化BE策略，拓宽了植物基因组编辑工具箱，并且在对编辑结果需要更高控制的应用中可能具有优势，尽管其总体编辑效率较低。
1 研究背景与目的
碱基编辑（base editing, BE）技术已在拟南芥、小立碗藓（Physcomitrium patens）以及玉米、小麦等作物中完成验证，但获得理想的等位变异仍不直接，往往需要多轮优化。胞嘧啶碱基编辑器（cytidine base editor, CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor, ABE）的编辑结果由R-loop内的活性“窗口”决定，窗口内多个胞嘧啶或腺嘌呤都可能被修饰，产生旁观者编辑和副产物。目前植物CBE大多采用融合架构（Fused-BE），即胞嘧啶脱氨酶与Cas9切口酶共价连接。这种构型通常能保证高编辑效率，但也容易造成窗口内多胞嘧啶编辑、indels及窗口外编辑；同时，更换脱氨酶、linker或Cas9变体时往往需要重建完整融合构建体，筛选组合耗时费力。已有模块化或拆分BE策略依赖intein介导的蛋白重构或MS2-MCP等工程化RNA-蛋白互作，仍需要特殊的招募系统。本研究提出了一种更简单的模块化策略Free-BE，将胞嘧啶脱氨酶与Cas9切口酶作为两个独立蛋白分别表达，假设脱氨酶与Cas9产生的R-loop短暂独立结合仍足以完成碱基编辑，同时可减少脱氨酶长时间暴露带来的副产物。
2 主要技术方法
研究人员以小立碗藓Gransden株系为模式材料，利用腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APT）报告基因和2-氟腺嘌呤（2-FA）筛选比较Free-BE与Fused-BE的编辑效率与编辑质量；在玉米A188原生质体中采用BFP-to-GFP瞬时报告系统检测靶向碱基转换；在小麦品种Fielder中通过农杆菌介导稳定转化验证内源基因编辑。主要方法包括PEG介导原生质体转染、Sanger测序、扩增子二代测序（NGS）以及Kruskal-Wallis检验和Fisher精确检验。
3 研究结果
3.1 在小立碗藓中验证Free-BE策略
研究人员使用两个靶向APT基因的sgRNA比较Fused-BE和Free-BE。Fused-BE使APT失活的相对频率为7.1%（sgRNA#21）和5.6%（sgRNA#22）；Free-BE也能编辑APT基因，但效率显著较低，分别为2.9%和1.9%。单独表达SpCas9切口酶时突变频率极低（0.004%和0.008%），证明Free-BE的致突变活性主要来自脱氨酶。
3.2 Free-BE与Fused-BE的编辑质量不同
Sanger测序分析显示，Fused-BE的indel比例随窗口内胞嘧啶数量增加而升高，sgRNA#21为52.8%，sgRNA#22为7.5%；Free-BE在sgRNA#21下indel比例降至7.1%，sgRNA#22下为10.8%。此外，Free-BE产生的C-to-T转换比例低于Fused-BE（sgRNA#21为69.3%对80%，sgRNA#22为39.5%对76.3%），而C-to-G等颠换比例更高。对sgRNA#22的四个预测脱靶位点测序后，未在检测植株中发现突变。
3.3 编辑窗口内胞嘧啶的系统性编辑程度在Free-BE中更低
对于同一编辑植株，Free-BE生成的编辑胞嘧啶数量少于Fused-BE。Free-BE编辑植株中表现为单氨基酸变异的比例在sgRNA#21和sgRNA#22下分别为55%和82%，显著高于Fused-BE的6%和49%。
3.4 Free-BE可用于玉米原生质体基因组编辑
在玉米原生质体BFP-to-GFP报告系统中，Free-BE得到0.6%的GFP阳性细胞率，低于Fused-BE的1.5%；阴性对照的转换率仅为0.0087%和0.0245%，表明Free-BE在玉米细胞中具有靶向碱基编辑活性，但效率较弱。
3.5 Free-BE可用于小麦基因组编辑
通过农杆菌介导稳定转化小麦Fielder品种，研究人员获得77株Free-BE和291株Fused-BE的T0转化体。以20%突变reads为阈值，Free-BE有33株（42.9%）至少一个内源靶基因被编辑，Fused-BE有235株（80.8%）。Free-BE可同时编辑最多五个TaGASR7和TaLOX2同源基因（9.1%的编辑植株），Fused-BE可编辑全部六个同源基因（11.5%）。在小麦中，两种系统均主要产生C-to-T转换，也可产生C-to-A和C-to-G颠换，Free-BE未表现出在P. patens中观察到的颠换增加趋势。
3.6 多胞嘧啶编辑在Free-BE中更少
TaLOX2靶序列包含七个胞嘧啶。Fused-BE的单、双、三胞嘧啶编辑比例分别为21.7%、22.6%和12.6%；Free-BE则以单胞嘧啶编辑为主（50%），双和三胞嘧啶编辑比例仅为10.0%和3.8%。此外，Fused-BE可产生窗口外编辑（包括靠近PAM的C5/C9以及spacer外的C21），而Free-BE未发现此类事件。
4 讨论与结论
讨论指出，Free-BE在编辑效率上低于Fused-BE，但能减少副产物、降低多胞嘧啶编辑和窗口外编辑，并提高单氨基酸变异比例。Free-BE的模块化特性有利于对不同脱氨酶和Cas9变体进行组合筛选，减少克隆步骤。但研究也指出，脱靶分析仅限于少量预测位点，尚需在全基因组水平进行更全面的DNA和RNA脱靶评估，也需在稳定玉米转化体中进一步验证。研究结论可概括为：Free-BE是一种功能性模块化碱基编辑策略，拓宽了植物基因组编辑工具箱；尽管总体编辑效率较低，但在需要更严格控制编辑结果的应用中可能具有优势。
