《The Plant Journal》：The plant longevity gene AHL15 delays leaf senescence by repressing ORESARA1 and cytokinin degradation
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拟南芥（Arabidopsis thaliana，Arabidopsis）AT-HOOK MOTIF NUCLEAR LOCALIZED 15（AHL15）基因与多种长寿表型相关，并且过表达时可延长植物寿命。在本研究中，研究人员表明，除了先前描述的长寿表型外，
拟南芥（Arabidopsis thaliana，Arabidopsis）AT-HOOK MOTIF NUCLEAR LOCALIZED 15（AHL15）基因与多种长寿表型相关，并且过表达时可延长植物寿命。在本研究中，研究人员表明，除了先前描述的长寿表型外，拟南芥中AHL15的组成型过表达可延缓叶片衰老，而ahl15功能缺失会加速这一过程。在地塞米松（DEX）诱导的AHL15-GR于黑暗触发衰老期间发生核定位后，叶片呈现持绿表型，并抑制若干早期衰老相关基因的表达。其中，ORESARA1（ORE1）位点被AHL15直接结合，提示AHL15对衰老具有直接延缓效应。此外，研究人员证明，AHL15通过直接抑制若干参与细胞分裂素失活的CYTOKININ OXIDASE（CKX）基因的表达而发挥作用，从而导致黑暗诱导衰老期间细胞分裂素降解延迟。已知细胞分裂素抑制衰老，这一点连同ORE1表达下调，解释了AHL15对衰老的延缓效应。
研究背景与问题：叶片衰老是叶片光合机构被分解并回收至植物其他部位的过程，是叶片最终发育阶段，受多种转录因子调控。拟南芥中ORESARA1（ORE1，衰老关键转录因子）和NAC-LIKE, ACTIVATED BY AP3/PI（AtNAP）是主要衰老正调控因子，其功能缺失导致持绿表型。衰老启动后，叶绿素分解代谢基因（CCGs）上调，叶绿素（Chl）被降解，叶片黄化；养分从老叶再分配可提高植物在营养匮乏时的生存机会，但对叶菜和观赏植物而言，延迟衰老是理想性状。叶片衰老可由叶龄、黑暗、营养缺乏及乙烯、茉莉酸、脱落酸、水杨酸、独脚金内酯等诱导。乙烯经ETHYLENE INSENSITIVE 3（EIN3）促进ORE1和AtNAP转录；黑暗经PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR4/5（PIF4/PIF5）诱导ORE1和EIN3。细胞分裂素（CK，抑制叶片衰老的植物激素）经ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 3（AHK3，CK受体）和CYTOKININ RESPONSE FACTOR 6（CRF6，细胞分裂素响应因子）负调控衰老。CK合成依赖ISOPENTENYL TRANSFERASE（IPT）和LONELY GUY（LOG），降解依赖细胞分裂素氧化/脱氢酶（CKX，不可逆降解CK的酶）。此前仅MYB2和AtNAP被发现在衰老中调控CK水平：MYB2随年龄抑制IPT，AtNAP诱导CKX3。AHL15既往被鉴定为整株长寿调控因子，过表达可延迟开花和腋芽分生组织成熟，延长寿命并增加分枝与次生生长；ahl15功能缺失则加速这些过程。AHL家族成员冗余，AHL27过表达可延迟叶片衰老，AHL9则促进衰老，但AHL调控衰老的精确机制不清。因此，研究人员探究AHL15是否在器官水平延缓叶片衰老及其分子机制。
研究开展、结论与意义：研究人员以拟南芥Col-0、ahl15功能缺失突变体、p35S:3xFLAG-AHL15过表达系和p35S:AHL15-GR诱导系为材料，结合黑暗诱导和年龄依赖衰老分析，测定叶绿素、衰老标志基因表达、AHL15结合位点、CK代谢物及CKX抑制效应。结果表明，AHL15过表达延缓叶片衰老，ahl15功能缺失加速衰老；AHL15直接结合并抑制ORE1，同时直接抑制CKX2、CKX3和CKX5，延缓CK降解并维持CK水平，从而通过两条并行通路延缓叶片衰老。该研究将整株长寿与器官水平衰老联系起来，为作物持绿和货架期改良提供了潜在靶点。
关键技术与方法（不超过250字）：以拟南芥Col-0、ahl15功能缺失突变体、p35S:3xFLAG-AHL15过表达系及p35S:AHL15-GR诱导系为材料；采用黑暗诱导与年龄依赖叶片衰老表型分析，结合RGB图像归一化红值（Rn）和丙酮叶绿素提取定量衰老；用DEX诱导AHL15-GR核定位，逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测SAGs、ORE1、CKX、IPT、LOG；利用前期p35S:3xFLAG-AHL15全莲座染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据定位结合位点；采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱（UHPLC-MS/MS）测定CK代谢物；用trans-zeatin（tZ）和CKX抑制剂处理验证CK/CKX作用。
研究结果：
1. AHL15过表达延缓叶片衰老。通过黑暗诱导和年龄依赖实验，检测第五叶Rn和总Chl，发现AHL15过表达系衰老延迟，ahl15功能缺失系加速，且与AHL15表达水平相关。DEX诱导AHL15-GR核定位可复现持绿表型；RT-qPCR显示早期衰老标志SAG13和晚期标志SAG12受抑，SEN1略降低。结论：AHL15主要影响衰老早期启动，对黑暗响应干扰较弱。
2. AHL15直接抑制ORE1和若干CKX基因表达。通过ChIP-seq发现AHL15结合ORE1上下游及CKX2第二内含子、CKX3上游和下游、CKX5上下游，也结合IPT7、LOG1、LOG7、LOG8。DEX诱导后RT-qPCR显示ORE1、CKX2、CKX3、CKX5被抑制；黑暗诱导下mock处理中CKX与SAGs上升，而DEX处理中CKX显著较低，IPT7下调解延迟，LOG1和LOG8受抑，LOG7不受影响。23天前过表达系中CKX3、CKX5和ORE1表达较低。结论：AHL15直接抑制ORE1和CKX，可能通过抑制CK降解而非促进茎中CK合成来延缓叶片衰老。
3. AHL15过表达植株中细胞分裂素水平升高。通过UHPLC-MS/MS测定CK，黑暗衰老中总CK下降，但DEX处理下降较缓；isopentenyladenine（iP）葡萄糖苷趋势明显，iP碱基未检出，iP-9-glucoside（iP9G）在DEX处理中升高；trans-zeatin（tZ）和trans-zeatin riboside（tZR）在DEX处理中显著较高。cis-zeatine（cZ）碱基和cZG黑暗后升高，DEX处理5天后尤其高；dihydrozeatin（DHZ）衍生物在处理间无显著差异。tZ处理Col-0和ahl15均提高Chl并降低Rn，CKX抑制剂也延缓衰老。结论：AHL15通过抑制CKX维持tZ、tZR等CK水平，部分解释持绿；ahl15对CK响应较弱与其ORE1控制减弱有关。
讨论总结：AHL15除延长整株寿命外，还提高器官水平长寿。其通过抑制ORE1和CKX两条并行通路延缓衰老，且主要表现为转录抑制。ORE1受乙烯、脱落酸、黑暗及年龄等多因素诱导，也受miR164转录后抑制；AHL15是新的年龄相关ORE1抑制因子。CK长期被认为是衰老抑制因子，AtNAP诱导CKX，MYB2抑制IPT；AHL15拮抗AtNAP和MYB2，正调控CK。黑暗衰老中LOG1和IPT7下调，LOG8上升，LOG7稳定，cZ升高，说明CK合成部分维持；CKX诱导得到确认。ahl15单突变表型温和，可能因AHL功能冗余，成年叶表达的clade-A AHLs可能更重要。AHL27过表达也延迟衰老，提示多个clade-A AHLs可诱导延缓衰老。拟南芥含15个clade-A AHLs，作物基因组类似或更多；提高clade-A AHLs表达可作为改善植物长寿和货架期的育种靶点。
研究结论翻译：AHL15通过直接抑制ORE1表达以及下调CKX基因、延缓叶片中CK失活，从而通过多重机制延缓衰老；后者导致AHL15过表达叶片中CK水平升高，最终促进叶片衰老延迟。细胞分裂素已知抑制衰老；该作用与ORE1表达下调一起，解释了AHL15对衰老的延缓效应。提高clade-A AHLs表达可能是改善作物寿命和货架期的有前景策略。
