基于膜受体可溶性结构域纯化与生物物理表征的通用方法——以铜绿假单胞菌血红素受体HasR为模型

《Protein Science》：A generalizable method for the purification and biophysical characterization of bacterial membrane receptors

　　

膜嵌入型细菌受体难以以可溶形式表达和纯化，但其分离的结构域是结构研究和配体发现研究的重要工具。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）依赖TonB依赖性血红素受体HasR获取铁，该过程对其致病性至关重要。本研究报道了一种用于重组表达、纯化及生物物理表征两个直接参与血红素摄取的可溶性HasR结构域的稳健策略：N端plug结构域和Secretin/TonB短N端结构域。每个结构域均在Escherichia coli中单独表达并纯化至均一状态，通过圆二色光谱（circular dichroism, CD）、核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance, NMR）和质谱法（mass spectrometry, MS）确认其采用正确折叠的构象。随后研究人员构建了包含两个结构域的融合构建体，并系统评估了多种增溶标签。GST-His双亲和策略能够高效纯化该构建体，而单独使用His6标签导致蛋白不溶，HLT标签融合则出现非特异性蛋白水解。生物物理分析表明，Secretin/TonB短N端结构域在融合构建体中保持稳定折叠，而N端plug结构域部分变得无序，该发现进一步得到氢/氘交换质谱（hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS）的支持。综上，这些结果建立了一种从膜蛋白生产可溶性受体结构域的通用工作流程，并提供了经验证的HasR构建体，适用于下游配体筛选应用，包括适配体（aptamer）和纳米抗体（nanobody）发现。

膜受体可溶性结构域的纯化与表征：以铜绿假单胞菌HasR为模型系统的通用方法解读

一、研究背景与问题

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是ESKAPE病原体之一，具有多重耐药性，可在医疗环境中引发严重感染，尤其威胁囊性纤维化患者和免疫功能低下人群。铁是细菌生长的必需元素，脊椎动物通过将铁螯合在血红素（heme）中并隔离于蛋白内部来抵御感染，而铜绿假单胞菌已进化出多种利用血红素作为铁源的机制。其中，血红素同化系统（heme assimilation system, Has）依赖分泌型血红素载体蛋白HasA捕获胞外血红素，并将其递送至外膜受体HasR。HasR属于TonB依赖性转运体，由三个结构域组成：短N端Secretin/TonB结构域、N端plug结构域和胞外血红素配位环。其中plug结构域和胞外环含有关键残基His-221、His-624和Ile-694，介导血红素从holo-HasA向HasR的转移。

目前尚无铜绿假单胞菌HasR的实验结构，但其同源受体（来自Serratia marcescens）已有晶体结构报道。膜蛋白全长受体因含疏水跨膜区而难以可溶形式表达，但其分离的胞外和周质结构域常可在天然条件下重组生产，成为结构研究和配体筛选（如适配体和纳米抗体）的重要工具。然而，表达膜蛋白分离结构域面临结构域边界选择、可溶性和折叠受损、纯化策略定制等挑战。针对HasR，其可溶性结构域是治疗性配体发现的理想靶点，但目前缺乏经验证的、适合下游筛选的高质量构建体。

二、研究内容与意义

研究人员建立了一套从膜相关细菌受体生产可溶性结构域的稳健工作流程，以铜绿假单胞菌HasR的可溶性N端结构域为模型系统。通过系统筛选融合标签、采用双亲和纯化策略，并结合正交生物物理分析方法，研究人员生成了适用于下游结构研究和配体发现的高质量构建体。该研究的关键意义在于：一是确定了HasR双结构域构建体的有效增溶和纯化策略，证明简单的His₆标签融合不足以产生可溶性蛋白，而GST-His双标签设计兼具高溶解度、兼容顺序亲和纯化和多步骤稳健性能；二是建立了验证可溶性受体结构域结构完整性的方法框架，整合CD、nanoDSF、NMR和HDX-MS等多种技术；三是揭示了结构域上下文对折叠行为的显著影响——Secretin/TonB短N端结构域在单独表达和融合构建体中均保持稳定折叠，而N端plug结构域在单独表达时采用稳定折叠，在融合构建体中则变为弱结构化。该工作流程具有模块化和广泛适用性，可推广至其他TonB依赖性受体或难表达的细菌蛋白。

三、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：基于InterPro分类和AlphaFold3预测指导结构域边界选择；在Escherichia coli C41(DE3)细胞中重组表达各结构域和融合构建体；系统筛选三种融合标签（His₆、HLT、GST-His双标签）；采用GST亲和捕获（谷胱甘肽树脂）结合TEV蛋白酶切割、镍亲和层析和尺寸排阻层析（SEC）的三步纯化策略；使用ESI质谱确认蛋白身份和纯度；通过圆二色光谱（CD）结合BeStSel服务器分析二级结构；使用800 MHz NMR波谱评估折叠状态；采用nanoDSF测定热稳定性（熔解温度T_m）；利用氢/氘交换质谱（HDX-MS）获得残基水平的结构稳定性信息。蛋白样品均来自重组表达，无临床样本队列。

四、研究结果

4.1 重组HasR单个结构域可纯化且可溶

N端plug结构域经镍亲和层析、阴离子交换层析（ANEX）和SEC三步纯化，获得均一蛋白，ESI-MS确认分子量为16.9 kDa，产量约0.075 mg/L。Secretin/TonB短N端结构域经镍亲和层析和SEC两步纯化，获得均一蛋白，ESI-MS确认分子量为13.1 kDa，产量约12.3 mg/L，表达水平显著更高。

4.2 单个HasR结构域采用正确折叠构象

CD分析显示N端plug结构域以反平行β-折叠为主（37%），含少量α-螺旋（2%）和18%β-转角、44%无序区；Secretin/TonB短N端结构域含27%α-螺旋、17%β-折叠、14%β-转角和42%无序区。1D NMR谱显示两个结构域均具有良好分散的化学位移，2D NOESY实验证实存在长程空间接触，共同证明两个结构域独立可溶并采用明确的三级结构。

4.3 重组HasR构建体需要增溶标签融合

研究人员构建了包含N端plug和Secretin/TonB短N端结构域（按天然序列顺序）的融合构建体，评估了三种标签策略。His₆标签构建体表达强但几乎完全不溶（形成包涵体）；HLT标签显著改善溶解度，但凝血酶切割产生多个降解产物，长时间消化导致完整蛋白完全丢失；GST标签同样增强溶解度，且可切割的GST融合蛋白可通过谷胱甘肽树脂进行亲和分离，实现“双标签”（GST-HasR-His）纯化策略。

4.4 重组HasR构建体可通过GST和His₆双亲和层析策略高效纯化

采用三步纯化策略：第一步GST亲和捕获（谷胱甘肽树脂），凝血酶切割释放HasR-His₆构建体，GST保留在树脂上；第二步镍亲和层析去除大部分残留污染物，纯度达79%；第三步SEC抛光去除残余杂质，产生单一主峰。ESI-MS确认正确分子量和高纯度。关键优化在于蛋白酶选择：凝血酶导致HasR构建体广泛非特异性消化，而TEV蛋白酶提供特异高效切割，在线切割后纯度提升至87%，显著减少10-20 kDa降解产物。最终产量约0.5 mg/L。

4.5 HasR构建体采用部分折叠构象

CD分析显示构建体含11%α-螺旋、25%β-折叠、17%β-转角和49%无序区，与AlphaFold3预测一致。nanoDSF测得熔解温度为66±1.7°C，属于可溶性细菌蛋白的典型范围。1D NMR谱显示折叠结构域的特征性分散共振，同时存在大量随机卷曲区酰胺信号，与CD结果一致。将单个结构域NMR谱与融合构建体比较发现，完全折叠的N端plug结构域共振信号在构建体谱中缺失，表明plug结构域在与Secretin/TonB短N端结构域共表达时未采用相同的紧密β-折叠构象；而Secretin/TonB结构域共振信号保留，证明其在不同上下文中均保持稳定折叠。HDX-MS进一步提供残基水平证据：Secretin/TonB短N端结构域氘摄取低（<40%），为完全折叠稳定区域；N端plug结构域氘摄取升高至62%，环区（氨基酸160-180）高度灵活，预期β-折叠区（氨基酸130-150、200-220）呈中等氘摄取，表明弱稳定结构而非完全无序。

五、讨论与结论

讨论部分总结了该研究的核心贡献。研究人员确定了GST-HasR-His双标签设计为最优策略，提供高溶解度、顺序亲和纯化兼容性和多步骤稳健性能。双亲和方法可在早期高效去除宿主蛋白，在温和天然条件下纯化（无需去垢剂），且工作流程易于适应和放大。最终纯化策略——GST亲和捕获、TEV切割、His标签富集和SEC抛光——产出适用于下游生物物理分析的高纯度蛋白。该工作流程具有模块化特点，可推广至其他膜相关受体或难表达细菌蛋白。结构预测（AlphaFold）用于可视化结构域组织、确认构建体末端位于柔性区域，并为HDX-MS数据提供映射框架。研究人员还提出了推荐工作流程：预测引导的结构域边界选择、平行小规模筛选不同性质和尺寸的融合标签、优先双标签设计、筛选蛋白酶切割条件、SEC抛光、正交生物物理方法验证折叠，以及规模化生产。

研究结论指出，该研究建立了实用且可适应的方法，用于生产膜嵌入受体的可溶性结构域。增溶标签、双亲和纯化、特异性蛋白酶切割和全面折叠验证的组合提供了可靠的工作流程，可应用于其他TonB依赖性受体或难表达的细菌蛋白。该方法使高质量蛋白可用于生物物理和生化研究，促进未来针对细菌铁获取途径的结构表征和治疗性配体发现工作。