致病性GARS1?ETAQ突变驱动小鼠运动与感觉神经元亚群周围神经病理：NfL与periaxin血液生物标志物及治疗评估模型

《Progress in Neurobiology》：The neuropathy-causing GARS1?ETAQ mutation drives pathology in subsets of motor and sensory neurons in mice

导致神经病的GARS1^?ETAQ突变驱动小鼠运动与感觉神经元亚群病理。Gars^?ETAQ/+小鼠在周围神经亚群中表现出显著病理。雌性与雄性突变体的运动及感觉缺陷严重程度相似。血液神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）与periaxin是Gars^?ETAQ/+神经病理的有用生物标志物。Gars^?ETAQ/+小鼠可用于治疗测试与疾病机制评估。

Charcot-Marie-Tooth病（Charcot-Marie-Tooth disease, CMT）是最常见的遗传性神经肌肉疾病，患者表现为运动与感觉神经功能障碍，导致肌无力、肌萎缩、骨骼肌肉畸形、深腱反射消失和感觉缺陷，通常影响远端周围神经，多在青少年期显现并造成终生残疾。CMT主要分为脱髓鞘型CMT1和轴索型CMT2，目前仅有症状支持、手术和康复治疗。CMT及相关运动/感觉神经病可由130多个基因突变引起，其中最大的基因家族是氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases, ARSs），负责将氨基酸加载到同源转运RNA（transfer RNA, tRNA）上。GARS1编码甘氨酰-tRNA合成酶（glycyl-tRNA synthetase, GlyRS），是首个与神经病相关的ARS基因，其突变导致CMT2D（CMT type 2D）和远端遗传性运动神经病V型（distal hereditary motor neuropathy type V, dHMNV）。已有三种主要Gars突变小鼠模型：Gars^Nmf249/+、Gars^C201R/+和Gars^?ETAQ/+。Gars^?ETAQ/+由CRISPR/Cas9生成，表现为中间严重程度，但关于其血液生物标志物、感觉神经系统是否受累、运动神经元选择性易感模式以及前肢与后肢神经受累差异尚不清楚。因此，研究人员旨在更详细刻画Gars^?ETAQ/+表型，并评估后肢与前肢周围神经，以判断是否存在CMT2D/dHMNV患者中常见的上肢优势。

关键技术方法：研究使用Gars^?ETAQ/+和Gars^C201R/+雄性杂合突变体与雌性野生型繁殖对，维持在C57BL/6J背景，雌雄小鼠均评估，约3月龄处死，样本来源为UK Home Office许可下UCL Queen Square Institute of Neurology伦理审查批准的队列。方法包括体重与血液采集；单分子阵列（single molecule array, Simoa）检测血浆NfL、periaxin和血清peripherin，ELISA检测血浆GDF15；von Frey、平衡木、pinprick和Hargreaves测试评估感觉功能，wire-hang和握力测试评估运动功能；免疫荧光与共聚焦显微镜分析背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）、脊髓胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）阳性神经元、肌肉纺锤和神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）；Western blot检测蛋白；活体注射HCT-555并成像周围神经信号内体轴突运输。样本队列来源已注明。

研究结果：
3.1 Gars^?ETAQ/+ mice display reduced body weight and altered blood biomarkers。研究人员在3月龄雌雄突变体中进行称重和血液标志物检测，发现雌雄突变体体重均降低，雄性相对体重缺陷大于雌性；血浆NfL降低，periaxin升高，且两性一致；GDF15和peripherin未见显著改变。与Gars^C201R/+相比，Gars^?ETAQ/+的periaxin升高更明显，提示NfL和periaxin是该等位基因的有用血液生物标志物。

3.2 Sensory and motor function are impaired in Gars^?ETAQ/+ mice。感觉行为学显示，Gars^?ETAQ/+小鼠对较强von Frey刺激的反应频率降低，提示机械感觉减退；平衡木行走时爪滑次数增加，提示本体感觉缺陷；对有害pinprick的缩爪频率降低，提示机械痛觉减退；对有害热刺激缩爪更快，提示热痛觉增强。运动功能方面，wire-hang潜伏期和最大握力均降低。分性别分析显示这些缺陷在雌雄中均存在，提示周围神经功能损害不依赖性别。

3.3 Gars^?ETAQ/+ lumbar but not cervical DRG display altered sensory neuron populations。对L₁–L₅和C₄–C₈ DRG进行免疫荧光分析，发现腰段DRG中神经丝200阳性（neurofilament 200-positive, NF200⁺）神经元比例降低，peripherin⁺神经元比例升高，而颈段DRG无变化。此外，腰段NF200⁺神经元中GlyRS水平升高，颈段无变化。这表明Gars^?ETAQ/+感觉神经元身份和GlyRS水平在后肢支配区域选择性改变。

3.4 Spindle pathology is present in Gars^?ETAQ/+ soleus but not biceps brachii muscles。研究人员检查后肢比目鱼肌和前肢肱二头肌，发现Gars^?ETAQ/+比目鱼肌中肌梭数量减少且支配严重缺失，而肱二头肌中肌梭数量和支配无显著变化，提示本体感觉神经末梢缺陷具有后肢选择性。

3.5 Motor neuron size in the lumbar but not thoracic spinal cord is reduced in Gars^?ETAQ/+ mice。对腰段和胸段脊髓ChAT⁺运动神经元分析，发现Gars^?ETAQ/+腰段和胸段运动神经元数量均无丢失，但腰段运动神经元胞体面积选择性减小，胸段无变化。这与DRG和肌梭结果一致，支持后肢支配周围神经优先受累。

3.6 NMJ innervation and maturation are selectively impaired in Gars^?ETAQ/+ mice。研究人员检查ETA、前爪lumbrical、后爪lumbrical和FDB肌肉的NMJ，发现后爪lumbrical和FDB肌肉明显去神经，而ETA和前爪lumbrical病理有限；后爪lumbrical中NMJ数量减少，前爪lumbrical无减少；所有检测肌肉均出现多神经支配增加，提示突触成熟延迟。NMJ去神经与多神经支配呈正相关，说明延迟突触成熟与去神经支配是CMT2D小鼠的一致特征。

3.7 In vivo axonal transport of signalling endosomes is selectively perturbed in Gars^?ETAQ/+ motor neurons。通过HCT-555注射胫骨前肌、腓肠肌或前爪并进行活体成像，研究人员发现支配胫骨前肌的运动神经元中信号内体轴突运输速度降低，暂停时间无变化；支配腓肠肌和前爪肌肉的运动神经元无运输障碍。Western blot显示坐骨神经中单体Snapin、二聚体Snapin和RILP水平降低，ERK1/2磷酸化降低；median/ulnar神经中仅二聚体Snapin降低，其他无显著变化。这些结果提示内体衔接蛋白可用性降低和ERK1/2激活减弱与信号内体运输障碍相关。

讨论部分总结：周围神经对致病突变并非同等敏感。CMT常被视为长度依赖性疾病，但GARS1突变可导致上肢优势表型，且GARS1相关神经病通常先在特定手内肌出现。Gars^?ETAQ/+小鼠主要表现后肢运动与感觉神经易感，前肢相对保留，与Gars^C201R/+一致，但与人类临床模式存在差异，原因尚未确定。讨论提出，小鼠四足行走的生物力学背景、前肢肌肉骨骼解剖差异、所模拟突变本身的下肢优势、其他前肢肌肉受累或分子组成差异等可能解释该差异。关于性别和品系，雌雄Gars^?ETAQ/+神经病严重程度相似，尽管雄性相对体重更低；Gars^?ETAQ/+与Gars^C201R/+总体严重程度相近，部分表型稍重，但需并排比较确认。生物标志物方面，血浆NfL降低出乎意料，可能与晚期取材、整合应激反应、慢轴突运输受损、轴突口径减小或NfL mRNA稳定性改变有关；periaxin升高支持施万细胞受累，尽管CMT2D临床分类为轴索型；GDF15和peripherin无变化可能与取材时间或血分选择有关。局限性包括仅评估单一时间点、部分实验性别差异统计功效不足、未进行神经元计数、未评估NMJ神经传递。研究结论翻译：研究人员表明，Gars^?ETAQ/+小鼠表现出稳健且选择性的周围神经病理，并导致明确的功能缺陷。此外，研究人员确认NfL和periaxin是该模型中客观评估神经退行性变的有用血液生物标志物，感觉神经系统表现出明确的功能和形态学破坏，且存在与Gars^C201R/+小鼠相似的NMJ去神经支配模式。这项工作不仅确认Gars^?ETAQ/+小鼠用于测试治疗和评估选择性神经易感性机制的实用性，还证明了Gars^Nmf249/+和Gars^C201R/+品系的有效性。尽管相应的自发和诱变诱导突变可能永远不会在人类中鉴定到，这些模型表现出与Gars^?ETAQ/+小鼠惊人相似的表型，证实疾病模型小鼠不需要携带患者来源突变即可重现疾病关键特征。