适配体接枝氨基功能化共价有机框架用于四种黄曲霉毒素的同时优异专一性和高容量吸附

《Talanta》：Aptamer-grafted amino-functionalized covalent organic frameworks for simultaneous exceptional selectivity and high-capacity adsorption of four aflatoxins

　　

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  构建了一种新型Apt@NH₂-COF，用于选择性富集四种黄曲霉毒素。
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  共价适配体固定化策略提高了基于COF的分子识别能力。
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  Apt@NH₂-COF吸附剂兼具高吸附容量与目标特异性。
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  所提出的方法减少了基体干扰，实现了超低检测限。

引言

黄曲霉素的强致癌性使其成为全球食品安全监测的首要关注对象 [1]、[2]、[3]、[4]。其二呋喃环和香豆素结构的持久性使黄曲霉毒素难以在食品中降解，导致其通过食物链在人体或动物体内积累中毒 [5]、[6]。针对这一风险，国际监管机构对玉米和花生等食品中的黄曲霉毒素制定了严格且通常非常低的最大限量。根据现行欧盟法规2023/915，直接供人食用的花生、谷物及谷物产品中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的最高允许限量为2 μg kg^–1 [7]、[8]。AFB₁、黄曲霉毒素B₂（AFB₂）、黄曲霉毒素G₁（AFG₁）和黄曲霉毒素G₂（AFG₂）的总和限量为4 μg kg^–1 [9]。此外，美国食品药品监督管理局提出，人类食品中黄曲霉毒素的限量不得超过20 μg kg^–1 [10]。满足这些严格的监管标准要求具有极高灵敏度和可靠性的分析方法。然而，相关样本基体的固有复杂性，如食品样本，构成了根本性障碍。这些样本中含有丰富的共提取物，如脂质和色素，众所周知，这些物质会在仪器分析过程中引起显著的基体效应 [11]、[12]、[13]。这些效应会严重降低定量准确性。因此，现有方法面临一个持续的挑战，即从这些复杂基体中高效净化和精确富集黄曲霉毒素的能力有限，这凸显了对创新分析解决方案的迫切需求。

鉴于其高通量、优异的选择性和出色的灵敏度，高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）已成为在多种复杂基体中定量痕量黄曲霉毒素的首选技术 [14]、[15]。然而，该技术的有效性从根本上依赖于样品前处理步骤的性能。共提取的基体成分可能通过在质谱检测过程中产生抑制或增强效应来干扰目标分析物的离子化行为 [16]。实证研究表明，在花生酱等基体中，AFB₁的信号抑制超过30%，这种效应归因于共流出的脂质 [17]、[18]、[19]。如果不进行适当校正，就会产生显著的定量误差。这突显了，如果样品前处理过程中未充分解决基体干扰问题，即使最先进的检测平台也无法确保准确可靠的结果。因此，开发高效且稳健的前处理方法对于实现精确的黄曲霉毒素分析至关重要。固相萃取（SPE）被广泛采用作为该领域基体净化和分析物预浓缩的主要方法 [20]、[21]。在现有技术中，免疫亲和柱利用特定的抗原-抗体相互作用进行选择性捕获，被纳入许多官方方法 [22]。然而，生物识别元件的几个缺点限制了其实际应用，如成本高、易变性、批次间差异等，阻碍了成本效益的规模化应用。或者，广泛使用的具有反相或亲水-亲脂平衡化学的吸附剂具有更广的覆盖范围和更低的成本 [23]。然而，这些吸附剂依赖于非特异性分子间相互作用。在处理高度复杂的样品如食品提取物时，这些吸附剂的有限分子特异性成为关键缺陷。由于其非选择性特性，目标毒素的结构类似物往往与分析物一起被保留。这不仅导致目标物的富集不足，而且最终增加了分析不准确的风险。

将先进的多孔材料与人工识别元件结合提供了一种克服这一限制的有前景的策略。共价有机框架（COFs）作为高性能吸附平台获得了广泛关注，这主要归功于其极高的比表面积、可调的孔隙率和稳健的化学稳定性 [24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。与硅基和碳基吸附剂相比，后者的表面官能团通常缺乏结构可编程性，COFs在将特定反应基团引入其框架方面提供了更大的灵活性。与金属有机框架相比，COFs的无金属和共价连接特性可以为后合成官能化提供一个有用的平台，同时避免了与目标分析物之间可能发生的金属位点相关相互作用 [31]、[32]、[33]。这些特性对于构建亲和吸附剂尤为重要，因为亲和吸附剂既需要可及的孔隙率，也需要可控的表面化学。近期的进展展示了COFs基材料在真菌毒素分析方面的潜力。Zhou等人开发了一种基于COF的智能手机生物传感器，用于同时检测和降解AFB₁ [34]，而Zhang及其团队报道了基于Fe₃O₄/ZIFs的磁固相萃取法用于提取AFB₁前体 [35]。值得注意的是，迄今为止大多数用于黄曲霉毒素吸附研究的共价有机框架依赖于非特异性相互作用，这导致从含有多种干扰物质的实际样品中目标提取的选择性不足。与此同时，适配体作为一种有吸引力的人工识别配体而崭露头角 [36]、[37]。这些单链寡核苷酸能够以高亲和力和特异性结合靶标，并在稳定性和合成可及性方面具有优势 [38]、[39]。然而，为了获得适配体的最佳性能，需要一种理想的载体，它不仅能够提供高密度的固定位点，还能维持其生物活性构象。传统树脂通常无法同时满足这两个要求。因此，将COFs出色的富集能力与适配体的精确分子识别特性相结合，已成为开发新型杂化亲和材料的合理研究方向。该概念的成功实现关键在于解决在框架表面实现适配体定向、稳定且高密度固定化的挑战。

本文中，为解决这一特定挑战，通过后合成修饰和定向共价固定化开发了一种适配体功能化的共价有机框架。选择Tpb-Dva-COF作为支撑框架，因为其富含乙烯基的结构为后续化学功能化提供了合适的基础。首先用氨基修饰该框架以引入反应位点，然后通过异双功能交联剂与巯基修饰的适配体进行共价偶联，得到Apt@NH₂-COF（图1）。该设计旨在保留COF的可及多孔结构，同时引入适配体介导的分子识别。通过密度泛函理论计算和分子对接进一步研究了吸附机制。随后，将Apt@NH₂-COF作为固相萃取吸附剂与UPLC-MS/MS联用，评估了其在复杂食品基体中同时测定四种黄曲霉毒素的分析性能。本研究提供了一种提高基于COF的样品前处理选择性的有效策略，并扩展了亲和功能化多孔材料在真菌毒素分析中的应用。

节选

实验

关于试剂、仪器和装置、适配体接枝率和接枝量的优化方法、密度泛函理论计算过程、样品前处理方法、SPE过程以及UPLC-MS/MS分析方法的相关信息均见补充材料（表S1和S2）。

所设计材料的表征

使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对Tpb-Dva-COF、NH₂-COF和Apt@NH₂-COF的表面形貌进行了表征。如SEM（图1A-C）和TEM（图1D-F）图像所示，即使经过两阶段合成修饰，Tpb-Dva-COF材料仍保持定义良好的均匀球形形貌，直径约为900 nm。TEM图像清楚地显示了……

结论

本文中，通过将黄曲霉毒素特异性适配体共价固定在高孔隙度COF上，制备了一种具有高选择性和高容量的吸附剂。与UPLC-MS/MS联用，该复合材料为一种高灵敏度和高准确度的分析方法提供了基础，能够同时定量四种主要黄曲霉毒素。实验数据和理论计算相结合阐明了富集机制，揭示了Apt@NH₂-COF的卓越性能主要可归因于……

CRediT作者贡献声明

Ziyue Ni：撰写——初稿、验证。 Yunlun Li：项目管理。 Qing Sun：调查研究。 Jingyu Zhao：形式分析。 Haiyue Sun：软件、数据整理。 Junhong Xin：撰写——审阅与编辑、资金获取、概念构思。 Zhixin Tang：方法论

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能影响本文报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（82304717）、山东省自然科学基金（ZR2023QH014）和山东中医药大学科研基金项目（51202504）的支持

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