《Synthetic and Systems Biotechnology》：A base-editing and auxotrophic selection platform for linking epigenetic regulators to silent biosynthetic gene clusters in
Aspergillus nidulans
编辑推荐：
丝状真菌中含有大量沉默的生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs），是尚未充分开发的天然产物资源库。通过化学抑制表观遗传调控因子是激活沉默BGCs的有效策略，但该方法常缺乏特异性，且难以将激活的基因簇与其对应的调控因子直
丝状真菌中含有大量沉默的生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs），是尚未充分开发的天然产物资源库。通过化学抑制表观遗传调控因子是激活沉默BGCs的有效策略，但该方法常缺乏特异性，且难以将激活的基因簇与其对应的调控因子直接关联。在本研究中，研究人员在构巢曲霉（*Aspergillus nidulans*）中开发了一种偶联胞嘧啶碱基编辑（cytosine base editing, CBE）与营养缺陷筛选的平台，用以系统鉴定沉默基因簇的表观遗传调控因子。研究人员将靶向24个核心表观遗传调控因子的sgRNA文库与胞嘧啶碱基编辑器共同导入21株基于pyrG的聚酮合酶（polyketide synthase, PKS）报告菌株中，实现了基于生长表型的选择以及通过Sanger测序直接回收sgRNA。该筛选共鉴定出5对调控因子-基因簇激活组合，包括已知的相互作用以及两个此前未被表征的调控机制。具体而言，KdmB通过去除启动子区域的H3K4me3修饰来抑制AN7084基因簇，而Kmt5则通过介导H4K20me3沉积来沉默cichorine核心pks基因。该可扩展平台能够实现沉默BGCs与其表观遗传调控因子的快速匹配，并推动染色质引导的真菌基因组挖掘研究的发展。
**丝状真菌次级代谢的表观遗传调控网络解析：碱基编辑-营养缺陷筛选偶联平台的构建与应用**
丝状真菌是结构复杂的天然产物的重要来源，许多已上市药物如青霉素、洛伐他汀和棘白菌素均源于真菌次级代谢产物。全基因组测序揭示，丝状真菌基因组通常携带30至80个生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs），然而在标准实验室培养条件下，大多数BGCs处于转录沉默或极低表达状态。这一基因组潜力与可实验获取的化学多样性之间的巨大落差，持续制约着新型生物活性分子的发现。
表观遗传调控是真菌次级代谢的核心调控机制之一。组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等修饰状态直接决定次级代谢基因簇的染色质可及性与转录活性。自2009年首次报道真菌次级代谢受表观遗传调控以来，利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂等化合物进行化学扰动，已成为激活沉默BGCs的常用策略，并已推动逾540种新型天然产物的发现。然而，化学干预存在靶标混杂与多效性等固有缺陷：小分子抑制剂常同时作用于多个表观遗传酶家族，难以将特定BGC的激活准确归因于某一具体调控因子。基于同源重组的传统靶向基因缺失虽可建立调控因子与基因簇间的因果联系，但需逐一构建和分析突变体，通量低下。鉴于丝状真菌编码数十种表观遗传修饰酶，现有基因组挖掘策略缺乏能够快速、精确地将激活的BGCs与其对应表观遗传调控因子相匹配的高效方法。
CRISPR-Cas9胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）为解决上述挑战提供了有力的遗传工具。CBE可在不引入DNA双链断裂的情况下实现靶位点的C•G至T•A精准转换。通过合理设计sgRNA，可将靶基因特定密码子转换为提前终止密码子，从而实现高效基因失活。将CRISPR-Cas系统与sgRNA文库筛选相结合，已在合成生物学领域广泛应用于解析细胞对遗传扰动的响应。该范式的核心优势在于：对呈现特定表型的细胞进行sgRNA条形码测序，即可直接追溯致病的遗传扰动。然而，由于丝状真菌特有的遗传操作和实验挑战，高通量筛选策略在此类生物中仍鲜有应用。
研究人员在构巢曲霉中构建了一种将碱基编辑介导的调控因子高通量失活与特定沉默BGCs激活表型直接偶联的遗传筛选平台。研究人员首先构建了靶向构巢曲霉24个核心表观遗传调控因子的sgRNA文库，并将该文库与CBE表达质粒共同导入21株工程报告菌株。每株报告菌株中将营养缺陷标记基因pyrG置于一个沉默聚酮合酶（polyketide synthase, pks）基因启动子下游，从而将基因激活与生长表型偶联。在营养缺陷选择压力下，sgRNA盒与相应细胞的激活表型直接关联，仅通过Sanger测序即可建立调控因子-靶基因簇关系。利用该系统，研究人员鉴定出5对表观遗传调控因子-BGC关系，并揭示两个此前未知的调控机制：Kmt5介导的H4K20me3沉积沉默cichorine基因簇，而KdmB通过去除激活型H3K4me3标记维持AN7084基因簇的抑制状态。
**主要关键技术方法**
研究人员采用偶联胞嘧啶碱基编辑与营养缺陷筛选的平台（图1、图2A-B）。以构巢曲霉A1145 ΔSTΔEM为宿主（该菌株已敲除高表达的柄曲霉素stcA和emergellamide easA核心pks基因）。针对24个核心表观遗传调控因子各设计两条sgRNA，以tRNA-sgRNA阵列形式克隆至含AMA1复制子和pyroA筛选标记的载体，构建失活文库。CBE由携带riboB标记的独立AMA1质粒表达。通过同源重组将曲霉pyrG基因和bar抗性标记精确整合至21个靶pks基因开放阅读框，使pyrG受天然pks启动子驱动。采用PEG介导的原生质体转化法共转化文库质粒与CBE质粒，先在缺乏吡哆醇和核黄素培养基筛选双质粒维持，再复制接种至缺尿苷/尿嘧啶培养基或含pyrG抑制剂吡唑呋喃菌素培养基进行激活筛选。阳性克隆经PCR扩增sgRNA盒并Sanger测序鉴定失活调控因子。调控机制验证采用RT-qPCR检测转录水平、ChIP-qPCR检测组蛋白修饰变化，并以同源重组构建kdmB和kmt5基因敲除突变体排除CBE脱靶效应。
**研究结果**
**偶联碱基编辑与营养缺陷筛选平台的设计与验证**
研究人员将pyrG报告基因置于mdpG（pks）启动子控制下，在该工程菌株中利用CBE引入cclA功能缺失突变。cclA破坏解除了mdpG启动子的转录抑制，激活pyrG表达，使菌株在缺乏尿苷和尿嘧啶的培养基上恢复生长（图2B），初步验证了筛选策略的逻辑可行性与实践可行性。在21株报告菌株中，14株在选择培养基上完全不能生长，6株生长极为缓慢，1株（AN6791(P)-pyrG）生长旺盛（图2C）。添加PyrG抑制剂吡唑呋喃菌素可抑制缓慢生长菌株，但AN6791(P)-pyrG仍保持稳健生长，该菌株因此被排除后续筛选。
**表观遗传扰动与营养缺陷筛选鉴定调控因子-BGC对**
将CBE表达质粒与sgRNA文库共转化至20株报告菌株，在选择培养基上筛选到5个调控因子-pks激活对（图3B）：3个为已知组合（cclA-AN0150、cclA-AN7909和hosA-AN7909），测序确认靶基因位点发生预期C-to-T替换并产生提前终止密码子；2个为此前未报道的新组合——AN7084(P)-pyrG报告菌株中回收靶向kdmB的sgRNA（编码JmjC结构域H3K4me3去甲基化酶），AN6448(P)-pyrG报告菌株中鉴定到靶向kmt5的sgRNA（编码构巢曲霉唯一的H4K20甲基转移酶）。对随机选取的5个非靶pks基因在kdmB和kmt5失活菌株中的表达分析显示，多数非靶基因仅呈现微弱变化或无显著差异，表明上述调控关系并非源于全局性pks激活，而具有靶向基因簇偏好性。
**KdmB通过H3K4me3去甲基化沉默AN7084基因簇**
通过同源重组在AN7084-pyrG报告菌株中构建kdmB敲除突变体（kdmB KO），排除CBE脱靶效应。kdmB KO菌株在选择培养基上生长显著增强，液体选择培养基中细胞干重显著高于对照（图4B-C）。RT-qPCR显示kdmB缺失使核心基因AN7084表达上调约12倍，相邻簇基因AN7083和AN7085同步上调（图4D）。ChIP-qPCR证实kdmB KO菌株在AN7084和AN7083启动子区域H3K4me3水平显著高于野生型（图4E）。这些数据确立KdmB为AN7084基因的负调控因子，通过主动去除启动子上的激活型标记H3K4me3维持转录沉默。然而，在野生型背景中删除kdmB并构建kdmB/AN7084双突变体后，发酵提取物的比较代谢谱分析未显示可辨差异（图S4），提示kdmB缺失虽能启动簇转录，但不足以触发目标产物完整生物合成。
**Kmt5通过H4K20me3沉积沉默AN6448基因**
在AN6448(P)-pyrG报告菌株中敲除kmt5后，菌株在固体平板和液体培养中的生长速率均增加（图5B-C）。RT-qPCR显示kmt5缺失使AN6448转录上调约3.5倍，而相邻基因AN6447和AN6449表达基本不变（图5D），提示Kmt5以基因座特异方式主要靶向核心pks启动子。ChIP-qPCR证实野生型细胞AN6448启动子区域H4K20me3富集水平较高，该抑制标记在kmt5 KO突变体中显著降低（图5E）。综合结果确定Kmt5为基因座特异性沉默因子，通过H4K20me3沉积维持AN6448转录抑制状态。在野生型背景构建kmt5单突变体及kmt5/AN6448双突变体后，代谢谱分析未检测到可辨差异（图S6），原因可能在于去抑制效应的高度局部化——核心pks基因AN6448虽被激活，但完整生物合成途径所需辅助基因仍保持沉默。
**讨论与结论**
该研究开发的平台成功将表观遗传调控因子的碱基编辑失活与沉默BGCs激活表型偶联为可选择生长信号。该方法鉴定出5对调控因子-pks激活组合，其中两个新机制具有重要科学意义：KdmB（JmjC结构域H3K4me3去甲基化酶）通过去除活性染色质标记抑制AN7084基因簇——尽管KdmB此前已知兼具依赖催化域的抑制功能和不依赖JmjC域的激活功能，本研究提供了去甲基化酶依赖性抑制的明确实例；Kmt5（构巢曲霉唯一的H4K20甲基转移酶）以高度基因座特异方式通过H4K20me3沉积沉默cichorine核心pks基因——在镰刀菌属中Kmt5虽被证明影响次级代谢产物产生，但一直缺乏单基因簇染色质水平的直接证据。本平台相较传统化学激活策略具有关键优势：化学策略本质上以产物为导向，可能忽略未导致可检测代谢物积累的调控事件；而该平台通过生长表型直接报告启动子活性，能够捕获可能被遗漏的功能性调控因子-基因簇关系。该平台策略在构巢曲霉中验证成功后，可推广至已建立高效原生质体转化和CBE系统的其他真菌属，为系统解析丝状真菌次级代谢的表观遗传调控网络提供了可扩展的通用工具。
