纵向DNA甲基化动态变化区分儿童与青少年期持续性与缓解性注意缺陷多动障碍

《European Psychiatry》：Longitudinal DNA methylation dynamics distinguish persistent and remitted attention-deficit/hyperactivity disorder in childhood and adolescence

背景：注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder, ADHD）是一种神经发育障碍，其症状会随时间推移而缓解或持续存在。症状变化背后的生物学机制仍知之甚少，尽管表观遗传过程，如DNA甲基化（DNA methylation, DNAm），可能作为临床结局的动态生物标志物。本研究检测了患有和不患有ADHD的儿童和青少年的DNAm变化，包括缓解性和持续性ADHD之间的差异。 方法：研究人员分析了来自94名参与者（年龄9.5–14.5岁）的219份唾液样本，这些参与者参加了2至3轮NICAP（Neuroimaging of the Children’s Attention Project）研究。使用Infinium MethylationEPIC BeadChip对DNAm进行 profiling。线性混合模型校正了年龄、性别、药物、批次和细胞比例，评估了纵向变化。比较包括：(1) 患有与不患有ADHD的个体，(2) 持续性或缓解性ADHD与不患有ADHD的个体，以及(3) 持续性ADHD与缓解性ADHD。采用错误发现率（false discovery rate, FDR）校正控制多重检验（FDR-adjusted-p < 0.05）。 结果：比较(1)在校正多重检验后显示无显著发现。与不患有ADHD的个体相比(2)，持续性ADHD在2个位点的平均DNAm存在统计学差异（FDR-adjusted-p < 0.05），缓解性ADHD在3个位点存在统计学差异（FDR-adjusted-p < 0.03），并且持续性ADHD中另有3个额外CpG位点的甲基化发生了差异性变化（FDR-adjusted-p < 0.04）。缓解性ADHD与持续性ADHD(3)在4个CpG位点上存在差异，包括cg21443143（ZFAT），该位点显示出随时间推移的下降趋势。基因富集将研究发现与脑结构和功能联系起来，但这些关联未通过多重检验校正。 结论：本研究发现了几种表观遗传学差异，这些差异可将缓解性和持续性ADHD结局与典型发育以及彼此区分开来。鉴于该研究尚处于早期阶段，这些发现值得在这些诊断轨迹上进行进一步的前瞻性全表观基因组研究。

论文解读：纵向DNA甲基化动态区分儿童与青少年期ADHD的持续与缓解

一、研究背景与意义

注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder, ADHD）是一种常见的神经发育障碍，全球约5%的儿童和青少年受累。其核心症状——注意力不集中、多动和冲动——在不同个体间及个体内部均表现出显著的异质性，部分患者症状可持续至成年，而另一些患者的症状则在青春期得到缓解。然而，导致这种不同临床结局的分子生物学机制目前尚不完全清楚。既往研究表明，遗传和环境因素共同参与了ADHD的发生与发展。表观遗传过程，尤其是DNA甲基化（DNA methylation, DNAm），作为一种可响应环境刺激并调控基因表达的动态机制，在ADHD研究中日益受到关注。目前多数研究为横断面设计，旨在探究ADHD患者与对照者之间的甲基化差异，但结果不一致。更重要的是，关于ADHD症状轨迹变化的纵向表观遗传学研究极为匮乏，尤其缺乏直接比较持续性和缓解性ADHD患者在发育过程中DNAm动态变化的研究。因此，本研究旨在填补这一空白，通过纵向追踪儿童和青少年的DNAm变化，探索能够区分ADHD不同临床结局的表观遗传学标记，为理解症状变化的生物学基础提供新视角，并为未来开发预后生物标志物奠定基础。

二、研究方法概述

本研究数据来源于澳大利亚墨尔本的“儿童注意力项目神经影像学子研究”（Neuroimaging of the Children’s Attention Project, NICAP）。研究对象为94名参与者，共收集了219份唾液样本，每位参与者至少提供了两个时间点的样本（年龄范围9.5-14.5岁）。DNAm profiling采用Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片，覆盖超过850,000个CpG位点。数据分析使用R语言中的线性混合模型（linear mixed models, LMMs），校正了年龄、性别、用药情况、批次效应和上皮细胞比例等协变量，并以参与者作为随机截距。为了聚焦于纵向变化，研究首先筛选出在全样本或特定诊断组内随时间发生显著变化（名义p值<0.05且变化幅度>5%）的CpG位点。随后，对这些筛选出的位点进行三组比较：(1) ADHD患者与对照组；(2) 持续性ADHD或缓解性ADHD分别与对照组；(3) 持续性ADHD与缓解性ADHD。所有比较均采用错误发现率（false discovery rate, FDR）进行多重检验校正。

三、研究结果

1. ADHD与对照组的纵向DNAm差异

在全样本筛选出的284,665个显示纵向变化的CpG位点中，研究人员未发现ADHD组（包含持续性和缓解性患者）与对照组之间存在经过多重校正后仍显著的总体诊断主效应或诊断与时间的交互效应。这表明，将不同类型的ADHD患者合并分析时，未能检测到稳健的组间甲基化差异。

2. 持续性ADHD与对照组的差异

当将ADHD患者按结局分组后，发现持续性ADHD组相对于对照组，在两个CpG位点（cg15550572 – PRKCZ，cg12577151 – ACAD9）表现出显著的低甲基化（即平均甲基化水平更低）。此外，还有三个CpG位点（cg26901352 – CCL17，cg17657037 – ITGB1BP3，cg19892195 – AGAP1）显示出显著的诊断与时间的交互作用，表明其甲基化随时间的变化轨迹在两组间存在差异。

3. 缓解性ADHD与对照组的差异

缓解性ADHD组相对于对照组，在三个CpG位点（cg11124426，cg02208776 – HSPE1:HSPD1，cg12881363 – MOV10L1）的平均甲基化水平存在显著差异。

4. 持续性ADHD与缓解性ADHD的直接比较

这是本研究的核心发现。结果显示，四个CpG位点在两组间存在显著差异。其中，三个位点（cg17601216 – PHF20L1，cg00060320 – KY，cg02968116）显示出显著的诊断主效应。特别值得注意的是，位于ZFAT基因上的cg21443143位点，表现出显著的诊断与时间交互作用：缓解性ADHD组的甲基化水平随年龄增长而显著下降，而持续性ADHD组则未见此趋势。

四、讨论与结论

本研究首次在儿童和青少年中，利用纵向唾液DNAm数据，探讨了区分持续性ADHD与缓解性ADHD的表观遗传特征。研究的主要优势在于其前瞻性、重复测量的设计，这使其能够捕捉到与临床症状变化相关的动态甲基化改变。

在讨论部分，研究人员指出，将ADHD患者作为一个整体与对照组比较时未发现显著差异，这与部分基于唾液的横断面研究结果一致，提示ADHD内部的异质性可能掩盖了潜在的信号。而当根据临床结局进行分层分析后，则鉴定出了多个有意义的差异位点。例如，在持续性ADHD中发现的低甲基化位点（如PRKCZ, ACAD9）及其相关的基因功能（如长期记忆、突触结构修饰），与已知的ADHD神经认知缺陷相符。特别是AGAP1基因的过度表达被认为可能对树突棘密度产生负面影响，这可能解释了持续性ADHD的病理机制。

最关键的发现是ZFAT基因（cg21443143）在缓解性ADHD中呈现的甲基化下降趋势。ZFAT编码一种参与免疫细胞存活和凋亡的转录调节因子，并与自身免疫性疾病有关。这一发现将免疫过程和炎症反应与ADHD的症状缓解联系起来，与近年来关于免疫失调参与ADHD病理生理的证据相呼应。尽管该位点与症状变化的直接关联未达统计显著性，但存在明显趋势，提示其可能是一个潜在的预后标志物。

研究结论翻译：本研究发现了几种表观遗传学差异，这些差异可将缓解性和持续性ADHD结局与典型发育以及彼此区分开来。鉴于该研究尚处于早期阶段，这些发现值得在这些诊断轨迹上进行进一步的前瞻性全表观基因组研究。