《Scientific Reports》：Apigenin restores apoptotic pathways and induces G2/M arrest via modulation of DNA methylation and expression of pro and anti-apoptotic genes in HeLa cells
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凋亡抵抗是宫颈癌进展的特征性表现，其成因在于肿瘤抑制活性的丧失与促生存通路的持续激活。本研究探讨了膳食黄酮类化合物芹菜素（Apigenin）对HeLa宫颈癌细胞增殖及凋亡信号通路的调控作用。计算机模拟分析（in silico analysis）显示，芹菜素对C
凋亡抵抗是宫颈癌进展的特征性表现，其成因在于肿瘤抑制活性的丧失与促生存通路的持续激活。本研究探讨了膳食黄酮类化合物芹菜素（Apigenin）对HeLa宫颈癌细胞增殖及凋亡信号通路的调控作用。计算机模拟分析（in silico analysis）显示，芹菜素对CDK1、CDK2、XIAP及cIAP具有强结合亲和力，提示其可竞争性抑制这些蛋白与其天然配体的相互作用。体外研究（in vitro studies）表明，以芹菜素（24及48小时，1–175 μM）处理HeLa细胞可导致剂量及时间依赖性的细胞活力下降、线粒体膜去极化、G2/M期阻滞及凋亡细胞群体增加。上述表型改变伴随促凋亡基因及肿瘤抑制基因（DIABLO、BAX、CASP3、CASP8、p53、DAPK1）的过表达，以及抗凋亡基因（BCL2、XIAP、Survivin）的下调，该变化在蛋白水平上保持一致。跨CpG背景的甲基化测序（methylation sequencing）表明，差异DNA甲基化与转录变化相一致，其中CpG岛甲基化的改变（而非非CpG背景）与凋亡及抗凋亡基因表达变化的相关性最为显著。上述发现确立了CpG甲基化作为驱动芹菜素诱导转录重编程的关键表观遗传机制，将芹菜素定位为兼具诱导凋亡与调控宫颈癌表观基因组双重功能的药物，对强化癌症管理策略具有潜在意义。
一、研究背景与意义
癌症本质上是一种细胞增殖与存活调控失常的疾病，源于扰乱关键信号通路与蛋白的遗传及表观遗传改变。肿瘤发生常涉及增殖信号通路（如PI3K/AKT、MAPK、Wnt/β-catenin通路）的激活、通过上调IAPs、Bcl-2和Survivin实现凋亡逃逸，以及p53和BAX等肿瘤抑制因子的功能抑制，这些因素共同导致细胞不受控制的分裂与存活。凋亡作为重要的肿瘤抑制机制，通过清除受损或异常细胞发挥作用，但在癌细胞中常发生失调，使癌细胞得以逃避死亡信号而持续增殖。除p53等肿瘤抑制因子失活外，抗凋亡蛋白如BCL-2、Survivin和XIAP的过表达也介导了凋亡抵抗，干扰内外源性凋亡信号，加速癌症发展并增加治疗耐药性。
植物化学物及化学预防药物提供了一种以低毒性恢复凋亡调控的可行途径。黄酮类化合物广泛存在于水果、蔬菜和草药中，其多靶点抗癌作用涵盖细胞周期阻滞、血管生成与转移抑制及凋亡调控。芹菜素（4′,5,7-三羟基黄酮）存在于欧芹、洋甘菊、芹菜、洋葱及部分中草药中，具有强抗氧化、抗炎和抗肿瘤特性，且对正常细胞毒性较低。在多种癌症中，芹菜素已被证实可通过诱导细胞周期阻滞（常为G0/G1或G2/M期）及经由线粒体（内源性）和死亡受体（外源性）通路促进凋亡来抑制增殖。
DNA甲基化是调控基因表达的关键表观遗传机制，在CpG、CHH和CHG等不同序列背景下向胞嘧啶残基添加甲基。CpG岛通常位于基因启动子区，其高甲基化与肿瘤抑制基因沉默相关，而低甲基化可导致癌基因激活。在宫颈癌中，CpG甲基化常发生失调，与异常基因表达直接相关，而CHG和CHH甲基化相对稳定。本研究旨在通过分子对接、动力学模拟、细胞毒性检测、基因/蛋白表达谱分析及机制研究，明确芹菜素作为凋亡诱导剂的作用，并评估凋亡基因的CpG、CHH和CHG甲基化模式，揭示芹菜素如何瓦解HeLa细胞存活信号，以及CpG、CHH和CHG甲基化变化如何可能恢复程序性细胞死亡，为宫颈癌治疗提供新途径。
二、主要技术方法
研究人员综合运用了多种方法：计算机模拟方面，采用分子对接分析芹菜素与CDK1、CDK2、XIAP、cIAP等靶蛋白的结合亲和力及结合位点，并通过分子动力学模拟（100ns）及能量最小化分析评估复合物稳定性；体外实验方面，使用MTT法检测细胞活力、PI染色观察细胞核形态、DNA laddering检测DNA片段化、流式细胞术分析细胞周期及Annexin V/PI双染凋亡检测、TMRE染色评估线粒体膜电位、ELISA检测caspase-3/8/9活性及p53活性；基因表达分析采用qPCR，蛋白表达采用蛋白芯片技术；表观遗传分析采用甲基化测序评估CpG、CHH和CHG背景的甲基化变化；此外还利用STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用网络分析及GO富集分析。
三、研究结果
芹菜素抑制细胞活力，诱导核形态改变及特征性DNA梯形条带
MTT检测显示，芹菜素以剂量和时间依赖性方式降低HeLa细胞活力，24小时IC50为75 μM，48小时为10 μM。PI染色观察到核出泡、细胞质外溢和凋亡小体等典型凋亡特征，且凋亡细胞数量随浓度增加而增多。DNA laddering实验显示处理组出现特征性梯形条带，而对照组DNA保持完整。
芹菜素阻滞HeLa细胞于G2/M期并促进早期和晚期凋亡
流式细胞术分析显示，芹菜素处理后G2/M期细胞比例从对照组的10.1%分别升至10 μM组的14.9%和15 μM组的21.4%。Annexin V/PI双染显示，早期凋亡细胞从对照组的10.4%增至10 μM组的22.7%和15 μM组的26.7%，晚期凋亡细胞从13.7%增至21.4%和25.6%，呈剂量依赖性。
芹菜素破坏线粒体膜电位，升高caspase-3、8及p53水平
TMRE染色显示绿色荧光强度随芹菜素浓度增加而增强，表明线粒体膜电位（ΔΨm）呈剂量依赖性丧失。caspase-3和caspase-8活性显著升高，而caspase-9无显著变化，提示芹菜素可能触发外源性凋亡通路。ELISA检测显示p53活性随芹菜素剂量增加而升高。
凋亡与细胞周期关键调控因子间的蛋白-蛋白相互作用——网络分析
STRING网络分析显示caspases（CASP3、CASP7、CASP8、CASP9）和凋亡体组分APAF1为核心节点，与凋亡抑制蛋白（XIAP、BIRC2–8）及促凋亡BCL-2家族成员（BAX、BAK、BNIP3）相互连接。抗凋亡蛋白（BCL2、BCL2L1、MCL1）和细胞周期调控因子（CDK1、CDK2、CDK4）体现了凋亡与增殖之间的交叉对话。DIABLO（Smac）被描绘为拮抗IAPs以促进caspase激活。
分子间相互作用提示芹菜素与天然抑制剂共享相似结合腔
蛋白-配体相互作用分析比较了靶蛋白天然配体结合位点与芹菜素相互作用的氨基酸残基，发现两者之间存在显著相似性，提示芹菜素占据相同或高度重叠的结合腔，可能模拟天然抑制剂的结合模式并发挥相当的抑制效果。
芹菜素与抗凋亡蛋白稳定结合
能量最小化分析显示，XIAP-芹菜素复合物具有最优能量谱，力场能量为-3895.9 kJ/mol，最小化能量为-5253.8 kJ/mol，稳定化差异ΔE为-1357.9 kJ/mol；c-IAP次之，ΔE为-1318 kJ/mol。结果表明芹菜素与XIAP和c-IAP形成稳定且能量有利的复合物，其中XIAP相互作用最强。
分子模拟显示芹菜素与蛋白复合物的稳定性
RMSD和RMSF分析显示，XIAP-芹菜素复合物RMSD值最低（3.77 ?），表明结构变异小、整体稳定性强；c-IAP-芹菜素复合物RMSD为4.78 ?，仍在稳定蛋白-配体相互作用的可接受范围内。
芹菜素处理后凋亡基因表达（mRNA转录水平和蛋白表达）得以恢复
qPCR分析显示，DIABLO（约12倍）、BAX（约8倍）和BIRC6（约8倍）显著诱导，RIPK1和BIRC5/EPIR1约6倍上调，效应caspases包括CASP8、CASP7和CASP3呈2–3倍中等程度上调；相反，BCL2、BCL2L1和XIAP等关键抗凋亡调控因子明显下调。蛋白水平上，Bad、Bax、caspase-3、caspase-8、细胞色素c等促凋亡蛋白上调，Bcl-2、cIAP-2、LIVIN和XIAP等抗凋亡蛋白显著下调。
CpG主导的DNA甲基化调控凋亡基因表达
CpG岛甲基化分析显示，APAF1、BAD、CASP3和DIABLO等关键凋亡基因在芹菜素处理后主要表现为低甲基化，与其mRNA和蛋白水平升高一致。而BAX、BID、CASP6、CASP9和MCL1等部分基因虽表现出相对CpG岛高甲基化但表达仍升高，体现了CpG岛调控的背景依赖性。CHG和CHH岛甲基化在处理组与未处理组间也存在显著差异，但未与基因或蛋白表达模式一致对应，可能反映药物诱导应激和凋亡信号相关的更广泛染色质重塑和表观遗传可塑性。
四、讨论与结论
化学预防利用天然或合成物质在癌症发展早期阶段进行干预。芹菜素作为强效化合物，可抑制细胞生长并促进癌细胞凋亡，其选择性靶向癌细胞而保护正常细胞的能力使其成为安全有效的癌症化学预防候选药物。本研究中，芹菜素对HeLa细胞的细胞毒性、凋亡诱导、线粒体功能障碍、caspase激活和p53上调等效应均得到验证。芹菜素通过直接抑制CDK2及激活p53-p21轴这一协调机制强制G2/M期阻滞，为其抗增殖和促凋亡作用提供了机制基础。分子对接研究表明芹菜素与XIAP/cIAP的相互作用类似于天然抑制剂，与体外观察到的caspase-3和caspase-8活性升高一致。基因表达谱显示促凋亡基因（SMAC/DIABLO、BAX、caspase-3）的mRNA和蛋白水平变化一致，支持芹菜素将细胞环境转向凋亡的作用。CpG甲基化作为关键表观遗传机制驱动芹菜素诱导的转录重编程，确立了芹菜素作为兼具诱导凋亡与调控宫颈癌表观基因组双重功能的药物，对增强癌症管理策略具有重要意义。
