《Nature Communications》：Spatial transcriptomics unveils the in situ cellular and molecular hallmarks of the lung in fatal COVID-19
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严重2019冠状病毒病（Coronavirus disease 2019, COVID-19）可诱导进行性弥漫性肺泡损伤（diffuse alveolar damage, DAD），导致致命结局。在此，研究人员利用COVID-19和对照肺样本的Visium空间
严重2019冠状病毒病（Coronavirus disease 2019, COVID-19）可诱导进行性弥漫性肺泡损伤（diffuse alveolar damage, DAD），导致致命结局。在此，研究人员利用COVID-19和对照肺样本的Visium空间转录组学（spatial transcriptomics）数据，解析驱动致命性COVID-19的细胞和分子事件。研究人员报告，在急性与增殖性DAD中，内皮细胞类型、I型肺泡上皮细胞（pneumocytes type I）和自然杀伤（natural killer, NK）细胞进行性丢失，同时髓系（myeloid）和基质（stromal）细胞，主要为支气管周围成纤维细胞（peribronchial fibroblasts, PBFs）持续增加。空间组织分析还鉴定出跨DAD模式的特定区室化，包括免疫特异性簇。重要的是，空间信息配体-受体相互作用（ligand-receptor interaction, LRI）分析揭示了定义COVID-19诱导DAD的细胞间通讯特征。转录因子（transcription factor, TF）活性富集分析将TGF-β通路鉴定为DAD驱动因素，突出了SMAD3和SMAD7活性在纤维化期间的拮抗作用。整合这些数据产生了支气管周围成纤维细胞中的信号激酶通路，并给出可干预的新靶点。最后，时空轨迹分析表征了肺泡上皮再生程序。
感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）引起COVID-19全球大流行，已报告超过7.75亿例确诊病例和超过700万例死亡。多数感染者表现轻微或无症状，但与肺损伤和急性呼吸窘迫综合征相关的呼吸衰竭是常见死因。严重病例的病理改变为弥漫性肺泡损伤（diffuse alveolar damage, DAD），包括急性期肺泡上皮病变、间质炎症和水肿，以及增殖期肺泡上皮增生和成纤维细胞增殖。该病肺损伤的分子背景尚未完全建立。既往研究多采用整体转录组或特定谱系分析，单细胞基因表达虽提供更细视角，却破坏肺解剖结构和空间细胞互作；有限空间研究多靶向蛋白或感兴趣区域。为克服这些问题，研究人员利用Visium空间转录组学（VisiumST）分析正常组织学和致命COVID-19相关DAD肺样本，并结合人类肺细胞图谱（Human Lung Cell Atlas, HLCA）注释细胞类型，揭示45种细胞类型的变化、细胞间通讯扰动和分子通路空间改变。该研究发表在《Nature Communications》。
关键技术方法（不超过250字）：该研究关键技术包括基于10× Visium的FFPE空间转录组学（VisiumST）、H&E和免疫组化验证；样本队列为19例COVID-19相关DAD患者的23份尸检肺组织（7例急性DAD、12例增殖性DAD）和4例形态正常、无SARS-CoV-2感染对照，另分析8例non-COVID-19 DAD、公共特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）Visium数据及HLCA参考。计算采用Space Ranger、scanpy、cell2location、scCODA、非负矩阵分解（non-negative matrix factorization, NMF）、GraphCompass、LIANA+、decoupleR、CollecTRI、PROGENy、MISTy、NCEM和stLearn PSTS等。试剂和具体操作从略。
研究结果：
COVID-19相关DAD组织学模式中肺细胞类型和细胞区室的鉴定。通过VisiumST、cell2location和HLCA，共分析91,068个spots，注释45种细胞类型。对照肺最丰富为内皮细胞类型；急性DAD内皮比例下降，免疫和基质增加；增殖性DAD以纤维化组织为主。上皮谱系中AT1在增殖性DAD较对照和急性DAD显著下调，AT2上调。内皮谱系中毛细血管类型进行性丢失。免疫谱系中肺泡巨噬细胞、CCL3
+和单核细胞衍生巨噬细胞增加，CD4和CD8 T细胞减少，NK细胞显著减少。基质谱系中PBFs在增殖性DAD激增。NMF鉴定8个空间区室，DAD模式发生区室化重排；GraphCompass和过滤曲线显示PBFs和AT2更强空间聚集，毛细血管内皮更分散。
COVID-19相关DAD中的空间细胞-细胞相互作用。通过LIANA+空间加权Cosine相似性对局部LRI进行NMF，得到三个因子。Factor 3最好区分对照和COVID-19 DAD，在增殖性DAD高，并富集TGF-β、耗竭EGFR；WNT在Factor 1富集、Factor 2耗竭。Factor 3主要LRIs包括TIMP1^CD63、APP^CD74、CD99^CD81、LUM^ITGB1及S100A9^CD68等。TF活性分析显示SMAD3上调、SMAD7下调；TF-only模型解释增殖性DAD中Factor 3评分中位50%方差。扩展HLCA分析显示SMAD3
+/SMAD7
-轴具COVID-19疾病特异性；ETV5下调，NKX2-1在增殖性DAD上调，IKZF1下调。
配体-受体相互作用和转录因子活性与细胞类型丰度的空间关系。通过MISTy多视角建模，联合Factor 3前25个LRI和每条件前10个TF活性解释spot中细胞类型丰度，平均多视角R
2=0.21；TF贡献中位65%，LRI中位35%。成纤维细胞丰度最好由SMAD3和SMAD7解释，TIMP1^CD63为PBFs预测因子。局部相似性显示TIMP1^CD63空间共聚集最高，APP^CD74第二，APP^AGER共聚集在DAD中下降，S100A9^CD68与髓系活化相关。PBFs与SMAD3共聚、与SMAD7分离。PBFs中推断ITGB1激活上调SMAD3、MYB、BRCA1并下调SMAD7、CIITA，激活ILK、AKT1、MAP2K4、MAPK14。MYB与髓系空间共表达增加；IKZF1与NK共聚集丢失；NKX2-1与AT2共定位在增殖性DAD增加。
作为微环境组成功能的细胞-细胞通讯。通过NCEM图神经网络显示，对照肺中NK细胞依赖CD8 T细胞、EC aerocyte capillary、CCL3
+肺泡巨噬细胞和AT1，此依赖在DAD中丢失；CD4 T细胞成为重要接收节点，依赖非经典单核细胞、平滑肌激活应激反应细胞、浆细胞、AT1（急性DAD）和AT2（增殖性DAD）；AT1依赖在急性DAD增加、增殖性DAD丢失；发送者谱在急性DAD保留谱系身份，增殖性DAD丢失。
时空轨迹：AT2-AT1上皮再生。通过stLearn PSTS定义AT2向AT1转变的时空轨迹，涉及clade 6和clade 9。clade 6上调AT1标志ICAM1、DPYSL2、ANGPTL2、AGER，下调AT2标志SFTPB、SCD、CYB5A；clade 9下调AT2标志并上调CAV1，提示更完全转变，clade 6为中间状态。结果支持严重COVID-19肺中AT2细胞尝试通过肺泡上皮再生程序补充AT1。
与non-COVID-19 DAD和特发性肺纤维化的空间转录组学比较。8例non-COVID-19 DAD中，3例采集于COVID-19大流行前。non-COVID-19 DAD显示免疫谱系超过内皮，基质中肺泡成纤维细胞占优，缺乏COVID-19中广谱活化髓系，PBFs不形成离散生态位。公共IPF数据中上皮和免疫更占优、内皮减少，低纤维化区AT2占优，PBFs不成单独生态位。表明所鉴定细胞和空间标志更符合COVID-19诱导DAD，而非一般纤维化损伤或非特异性DAD。
讨论部分总结：讨论指出，空间转录组克服了解离组织丢失微环境的问题。PBFs扩增、肺泡成纤维细胞和AT1/毛细血管内皮减少，NK丢失及IKZF1下调，S100A9^CD68和MYB参与髓系活化，TGF-β/SMAD3/SMAD7轴和TIMP1^CD63为核心，ITGB1及其下游AKT1、MAP2K4、MAPK14为候选靶点。AT2-AT1轨迹提示肺泡再生受损。治疗上可探索抗纤维化药、MAPK14抑制剂、整合素αvβ6抑制剂、NLRP3抑制剂等。局限包括回顾性临床注释不完全、病例复杂、缺乏纵向样本，研究为尸检样本，需谨慎；non-COVID-19 DAD、IPF和HLCA验证部分缓解。
研究结论部分翻译：该研究独特之处在于，研究人员提供了致命COVID-19中肺组织架构的细胞和分子标志的空间信息表征。这项详细的空间转录组学研究原位突出了疾病相关的细胞亚群组成变化、空间依赖性及被破坏的细胞间通讯程序，也构成新兴空间技术潜在转化应用的原则验证。该转变将需要在竞争性空间转录组平台之间进行严格基准比较研究、协调数据处理流程、设计用户友好数据库以存储和查询数据、自动化样本处理与数据分析流程以缩短结果交付时间，并伴随测序成本持续降低以及可扩展计算方法来利用空间转录组数据。与此相关，空间转录组学可构成人工智能在病理学和现代医学中应用的一个入口点。在此方面，研究人员对致命COVID-19肺细胞和分子架构改变的研究，可作为空间转录组学多功能性的优秀示例，以实现新基因组技术改善对人类许多疾病的理解和个体化管理的承诺。
