基于自下而上方法质疑神经酰胺通道与微结构域在凋亡诱导中的作用

《Scientific Reports》：Challenging a role for ceramide channels and microdomains in apoptosis induction using a bottom-up approach

　　

神经酰胺（ceramides）是鞘脂代谢中必需但具有潜在毒性的中间产物，可直接作用于线粒体触发凋亡性细胞死亡，但其潜在机制尚不清楚。一种模型假设神经酰胺在线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）形成稳定通道，通过直接释放细胞色素c（cytochrome c）诱导细胞死亡；另一种观点认为神经酰胺自组装成微结构域（microdomains），促进促凋亡Bcl-2蛋白Bax的膜插入和寡聚化，形成细胞色素c传导孔。为了质疑这些模型，研究人员分析了神经酰胺与重组Bax组合对模型膜渗漏性的影响。结果表明，单独的神经酰胺无法支持即使最小荧光标记物的膜通过。此外，研究人员发现神经酰胺不能替代心磷脂（cardiolipin）在促进Bax膜募集及其后续组装成功能性孔中的作用。这些数据反对神经酰胺在凋亡孔形成中的直接作用，并表明神经酰胺启动线粒体外膜透化的机制不依赖于神经酰胺通道或神经酰胺作为Bax的自主转位平台。

凋亡是调节性细胞死亡中研究最为透彻的形式，在个体发育、组织稳态和免疫系统正常功能中发挥关键作用。线粒体凋亡途径中，线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）透化导致细胞色素c（cytochrome c）释放是细胞死亡进程的不可逆节点，该过程受到B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）蛋白家族的严密调控。Bax是哺乳动物中主要的促凋亡Bcl-2蛋白之一，应激条件下在OMM上发生构象改变、寡聚化并形成细胞色素c传导孔。除蛋白质调控外，脂质成分尤其是神经酰胺（ceramides）也被认为可直接作用于线粒体触发凋亡。多种应激信号，如电离辐射、肿瘤坏死因子TNFα和化疗药物，都可见线粒体神经酰胺水平升高早于OMM透化；抑制神经酰胺蓄积则可阻止凋亡。然而，神经酰胺启动OMM透化的机制存在争议：一种模型认为神经酰胺在OMM上自组装为稳定通道，直接允许细胞色素c释放；另一种观点则认为神经酰胺形成微结构域，作为Bax膜插入和寡聚化的平台。此前关于神经酰胺通道的证据多来自平面脂双层电生理、分子动力学模拟和脂质体负染色，但缺乏体内直接证据，且部分结果相互矛盾。为此，研究人员采用自下而上的策略，在纯化模型膜体系中考察神经酰胺单独或与重组Bax组合对膜通透性的影响，以检验上述两种模型的核心前提。

研究人员首先经细菌表达系统纯化出人Bax单半胱氨酸突变体（S4C/C62S/C126S），通过intein-几丁质结合域自切割去除亲和标签，再经阴离子交换层析和尺寸排阻层析获得单体蛋白，并用DY-647P1进行半胱氨酸荧光标记，标记效率约74%。随后利用大单层脂质体（large unilamellar vesicles, LUVs）钙黄绿素（calcein）释放实验验证重组Bax的孔形成活性，以caspase-8裂解的Bid（cBid）激活Bax。膜通透性实验采用巨型单层脂质体（giant unilamellar vesicles, GUVs），结合共聚焦显微镜观测钙黄绿素（0.5 kDa）、10 kDa葡聚糖（Dex10）和70 kDa葡聚糖（Dex70）的膜通透性。Bax膜募集实验使用膜包被硅珠，通过DiI/DiO标记磷脂双分子层，定量DY-647P1标记的Bax（Bax647）与不同脂质膜的亲和力。这些方法均为体外模型系统，无样本队列来源。

主要结果包括四个部分。第一，“重组Bax的生产与功能表征”表明，纯化的重组Bax经过cBid激活后，可诱导含心磷脂（cardiolipin, CL）的LUVs释放钙黄绿素，释放动力学具有剂量依赖性；缺失Bax或CL时无释放，缺失cBid时释放显著降低，证明重组Bax功能完整，可用于后续分析。第二，“单独的神经酰胺不能在模型膜上创造稳定孔”部分，研究人员观察GUVs对Dex10和Dex70的通透性，发现含10 mol% C16:0神经酰胺（Cer16）或脑神经酰胺（以C18:0为主）的GUVs均完全不可通透，而含CL的GUVs在添加激活Bax后逐渐通透；即使引入磷脂酰乙醇胺（PE）以模拟OMM脂质环境，Cer16也不产生通透性。这表明神经酰胺本身不能形成允许细胞色素c大小分子通过的稳定孔。第三，“与心磷脂不同，神经酰胺不能介导Bax募集到模型膜”部分，采用膜包被硅珠实验，发现cBid激活的Bax647选择性结合到含10 mol% CL的膜上，而含Cer16或脑神经酰胺的膜几乎不结合Bax；当神经酰胺替代CL或与PC/PE混合时，Bax膜结合未增强，说明神经酰胺不具备直接支持Bax膜募集的活性。第四，“神经酰胺不能促进模型膜中Bax介导的孔装配”部分，在GUVs中，CL存在时激活Bax可介导Dex10和Dex70释放，而将CL替换为Cer16或脑神经酰胺后完全丧失成孔能力；在LUVs钙黄绿素释放实验中，CL可支持Bax诱导的释放，而神经酰胺（C16:0或脑神经酰胺）无任何释放活性。这些结果表明，神经酰胺无法替代CL在Bax膜结合、寡聚化及功能性孔装配中的关键作用。

讨论部分指出，神经酰胺的独特结构可影响膜双层的物理性质，如促进非双层相变和侧向结构域分离，但本研究与其形成稳定通道的模型不符。先前平面膜电生理方法可能检测到瞬时或离子选择性的传导缺陷，此类缺陷不足以容许荧光标记物通过，因此本研究结果并不排除神经酰胺诱导电生理可测的膜缺陷，但反对其形成稳定荧光可通透孔道。关于微结构域模型，尽管神经酰胺与CL均具有双层去稳定倾向，但实验显示神经酰胺不能支持Bax的膜招募和孔形成；因此，辐射诱导OMM中神经酰胺微结构域作为Bax自主转位平台的观点难以成立。研究人员推测，线粒体神经酰胺升高可能与OMM中残余CL协同，或者通过促进CL从线粒体内膜重分布至OMM，为Bax募集提供平台；另一种途径是神经酰胺通过与OMM蛋白VDAC1/VDAC2相互作用，调节Bax转位和凋亡。研究结论为：神经酰胺并不直接参与凋亡孔形成，其启动OMM透化的机制独立于神经酰胺通道，也并非神经酰胺单独作为Bax转位平台介导膜透化。