条件重编程患者来源鼻上皮细胞培养用于原发性纤毛运动障碍的体外诊断与药理学评估

《Cells》：Conditionally Reprogrammed Patient-Derived Nasal Epithelial Cell Cultures for In Vitro Diagnostics and Pharmacological Profiling in Primary Ciliary Dyskinesia

背景：患者来源的原代鼻上皮细胞（pNEC）的气-液界面（ALI）培养可支持原发性纤毛运动障碍（PCD）的诊断和体外表型分析；然而，细胞产量低仍是一个限制因素。研究人员旨在建立并优化适用于PCD个体pNEC的条件重编程细胞（CRC）技术，并将其用作不确定病例的诊断工具和药理学测试平台。方法：研究人员从36例个体（8例健康对照（HC），26例PCD，2例PCD候选者）获取pNEC，采用CRC技术扩增并在ALI条件下进行分化。评估了纤毛摆动频率（CBF）、黏液纤毛传输速度（MCTV）和培养形态。此外，研究人员评估了β受体激动剂克仑特罗对HC、PCD（DNAH11、CCDC40）以及携带双等位DNAH1变异的PCD候选者pNEC纤毛功能的影响。结果：CRC扩增成功率>90%，获得高细胞数量（平均9.65×106）。ALI分化产生了假复层纤毛化pNEC培养物。天然与培养pNEC之间的CBF相当。PCD培养物的MCTV较HC培养物显著降低（p<0.0001）。克仑特罗显著提高了HC和DNAH1培养物的CBF，但对CCDC40或DNAH11培养物无此效应。克仑特罗处理显著提高了HC的MCTV。结论：CRC技术为pNEC扩增提供了一个可扩展的平台，能够重现体内纤毛功能。通过实现基因型特异性药理学筛选，CRC可作为PCD功能性诊断和精准医学的工具。

论文解读

一、研究背景与问题

原发性纤毛运动障碍（Primary ciliary dyskinesia, PCD）是一种罕见的、大多为常染色体隐性遗传的单基因疾病，以运动纤毛功能障碍为特征，导致黏液纤毛清除（mucociliary clearance, MCC）受损，自儿童早期起即出现慢性、进行性黏液阻塞性肺部疾病。除慢性呼吸系统疾病外，PCD还可表现为内脏转位、慢性鼻窦炎、中耳炎和生育力低下。MCC受损导致黏液栓形成、持续性细菌感染和慢性中性粒细胞性炎症，最终进展为支气管扩张和不可逆的结构性肺损伤。目前已发现超过60个编码纤毛结构和功能相关蛋白的基因突变可导致PCD，缺陷表现为从纤毛静止到搏动幅度降低、旋转性或运动亢进性纤毛等一系列异常。

目前PCD的标准化诊断检测包括详细病史采集、鼻一氧化氮（nasal nitric oxide, nNO）测量、鼻上皮细胞高速视频显微分析（high-speed video microscopy analysis, HVMA）以评估纤毛摆动频率（ciliary beat frequency, CBF）和纤毛摆动模式（ciliary beat pattern, CBP）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和免疫荧光染色（immunofluorescence, IF）以可视化不同纤毛蛋白，以及基因检测。然而，仍有部分病例无法明确诊断。尽管基因诊断技术的进步提高了PCD的遗传学确诊率，但仍有30%–45%的PCD患者无法鉴定出基因缺陷。因此，功能性和结构性研究对于改善诊断、阐明疾病机制、识别突变特异性治疗靶点以及作为新型治疗策略的临床前测试平台至关重要。

鼻腔刷取获得的新鲜鼻上皮细胞是诊断检测的金标准，但新鲜刷取样本的结果解读可能因样本处理、感染或炎症导致的继发性纤毛功能损害而变得困难。因此，患者来源的原代鼻上皮细胞（patient-derived primary nasal epithelial cells, pNEC）需在气-液界面（air-liquid interface, ALI）培养以消除这些干扰因素进行功能表征。然而，直接培养患者来源细胞受限于鼻腔刷取的低细胞产量——分化细胞增殖能力有限，诊断产量在经验丰富的PCD中心仅为54%–83%，常需重复刷取和培养。本研究旨在利用此前已建立的用于囊性纤维化的条件重编程技术，提高PCD功能性检测和扩增的细胞产量。

二、研究设计与技术方法

研究人员从36例个体（8例健康对照（healthy controls, HC）、26例PCD患者、2例PCD候选者）获取鼻刷取pNEC，采用条件重编程细胞（conditionally reprogrammed cell, CRC）技术扩增。CRC技术依赖于将原代上皮细胞与经照射的小鼠成纤维细胞饲养层细胞以及Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632共培养，实现快速、可逆的增殖，同时抑制分化和凋亡。扩增后的细胞在ALI条件下分化培养21–35天，形成高度分化的假复层纤毛上皮。主要功能评估手段包括：高速视频显微分析（HVMA）测量CBF和活动面积；荧光微球示踪结合延时成像测量黏液纤毛传输速度（mucociliary transport velocity, MCTV）；免疫荧光染色评估培养形态和细胞类型组成。药理学测试采用β₂-肾上腺素能受体激动剂克仑特罗（clenbuterol，10 μM）基底侧给药，分别在急性刺激（立即检测）和慢性刺激（24 h、48 h）后评估纤毛功能变化。

三、研究结果

3.1 鼻上皮细胞的条件重编程

CRC扩增成功率在PCD培养物中为92.3%（26例中24例），在HC中为87.5%（8例中7例）。第2代时HC与PCD样本的群体倍增时间相当（HC：1.32天 vs. PCD：1.37天），不同超微结构缺陷类别之间无显著差异。HC（11.8×10⁶）和PCD供体（9.65×10⁶）在第1代的平均细胞产量相似，表明CRC技术成功克服了鼻腔刷取细胞产量低的限制，并支持生物样本库建立。

3.1.2 高度分化ALI培养物的组成与功能测试

免疫荧光染色显示，HC和PCD培养物中均鉴定出杯状细胞（MUC5AC⁺）、纤毛细胞（alpha-tubulin⁺）以及明确的紧密连接网络（ZO-1⁺），表明培养物重现了体内假复层形态和细胞类型组成。CBF测量显示，天然HC细胞平均CBF为7.25±1.25 Hz，PCD天然细胞CBF显著降低至4.32±2.2 Hz（p<0.05）。HC的ALI分化pNEC与天然pNEC的CBF相当（8.09±1.77 Hz vs. 7.25±1.25 Hz），PCD的ALI培养物CBF也与初始天然刷取样本相当（5.02±3.02 Hz vs. 4.32±2.24 Hz），表明CRC扩增和ALI分化保留了体内纤毛功能特征。纤毛运动从ODA/IDA或ODA缺陷个体的静止纤毛到正常超微结构个体接近健康对照范围的CBF不等。MCTV测量显示，HC培养物中微珠呈定向运输，而PCD培养物无运输能力，平均传输速度显著降低（HC：4.19 μm/s vs. PCD：0.11 μm/s；p<0.001），且与超微结构缺陷类别无关。

3.2 克仑特罗对CBF和活动面积的影响

在HC pNEC中，基底侧10 μM克仑特罗处理后所有时间点（立即、24 h、48 h）CBF均显著高于未处理对照组（均p<0.0001）。克仑特罗处理对DNAH11（n=4）或CCDC40（n=5）PCD培养物的CBF在任何时间点均无影响。在携带DNAH1变异的pNEC中（2例供体），克仑特罗处理在所有时间点均显著增加CBF（立即p<0.001；24 h p<0.01；48 h p<0.001）。活动面积方面，克仑特罗对HC无显著影响（18.26%–28.53%）；DNAH11（0.01%–0.20%）和CCDC40（0–0.89%）突变培养物的平均活动面积显著低于HC；克仑特罗对DNAH1变异培养物的活动面积无影响（15.25%–22.75%），且其活动面积与HC相当。

3.3 克仑特罗对MCTV的影响

急性和慢性克仑特罗处理显著增加了HC培养物的MCTV，但对DNAH11、CCDC40或DNAH1培养物无此效应。DNAH11、CCDC40和DNAH1培养物的MCTV均显著低于HC。

四、讨论与结论

本研究成功建立了CRC技术作为PCD中pNEC扩增的稳健且可扩展平台，成功率>90%，获得足够细胞用于ALI培养和生物样本库建立，克服了鼻腔刷取原代细胞数量低的长期限制。扩增细胞保持ALI分化能力，重现体内纤毛功能障碍，包括异常的CBF和MCTV。该模型可用于PCD候选基因的功能评估和临床前药理学测试，可能改善诊断并促进PCD的精准医学。

与iPSC和BMI1转导基底细胞等替代模型相比，CRC技术无需基因修饰和漫长的重编程周期，且可从婴儿期起用于快速功能诊断和个性化药理学测试。CRC扩增的pNEC可冻存和再分化，支持纵向研究。克仑特罗的基因型特异性效应——在HC和DNAH1变异培养物中增加CBF，但对CCDC40和DNAH11无效应——提供了利用患者来源CRC ALI培养物进行基因型特异性临床前治疗策略测试的概念验证。值得注意的是，DNAH1培养物中CBF增加但MCTV未改善，表明正常CBF本身不足以实现有效的黏液纤毛运输。DNAH1目前被归类为PCD候选基因，本研究中两例携带复合杂合DNAH1错义变异的个体表现出符合PCD的临床表型和体外MCTV显著降低，提示DNAH1可能具有致病性。

研究局限性包括：可用患者和PCD基因型数量有限可能限制数据普适性；CRC技术在高传代次数下可能存在表型漂移或特定祖细胞亚群的选择性扩增；体外模型缺乏PCD体内典型的炎症环境和黏液性质改变；DNAH1相关发现需在更大规模多中心队列中验证。研究结论支持CRC技术为扩增患者来源pNEC提供高效可扩展平台，重现PCD患者体内纤毛功能和黏液纤毛运输，该模型可支持功能性诊断、新型疗法临床前测试以及PCD和其他形式支气管扩张的个性化医疗。