富含花青素的桑葚（Morus alba L.）果实提取物磷脂复合物（Phytosome）保护神经元细胞抵御氧化应激诱导的细胞毒性

《Foods》：Anthocyanin-Rich Morus alba L. Fruit Extract Phytosome Protects Neuronal Cells Against Oxidative Stress-Induced Cytotoxicity

　　

本研究探讨了富含花青素的桑葚（Morus alba L.）果实提取物磷脂复合物（MAP）对过氧化氢（H2O2）诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激及细胞损伤的神经保护潜力。研究人员在H2O2暴露前及暴露期间对细胞施以MAP处理。分别采用MTT法和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估细胞活力与细胞毒性。通过检测细胞内活性氧（ROS）生成及丙二醛（MDA）蓄积评估氧化应激水平，同时测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性以评价抗氧化状态。通过肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和核因子κB（NF-κB）的表达评估炎症反应。此外，还分析了包括B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）在内的凋亡相关蛋白。通过测定组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性和去乙酰化酶1（SIRT1）表达评估HDAC/SIRT1相关反应。MAP处理显著改善了细胞活力并减少了H2O2暴露后的LDH释放。这些效应伴随HDAC活性的显著降低和SIRT1表达的增加，同时与ROS生成和脂质过氧化减少、内源性抗氧化防御增强、炎症介质表达减弱以及凋亡相关信号通路调节相一致。综上，这些发现提示HDAC活性和SIRT1表达的调节可能有助于MAP的保护活性，并伴随氧化应激、炎症及凋亡相关反应的减弱。有必要在动物模型和人类中开展进一步研究，以验证MAP的神经保护潜力并评估其作为食物来源生物活性成分的应用前景。

论文解读文章

一、研究背景与目的

氧化应激是神经元功能障碍及神经退行性疾病发生发展的关键病理机制。过量活性氧（ROS）的产生破坏细胞氧化还原稳态，损伤细胞大分子并损害线粒体功能，最终导致神经元损伤。除直接氧化损伤外，ROS还可激活炎症信号通路和凋亡级联反应，从而加剧神经元死亡。因此，减轻氧化应激及其下游病理后果的策略在神经退行性疾病的预防和管理中受到广泛关注。

近年来的研究证据表明，氧化应激不仅造成细胞损伤，还影响表观遗传调控。在参与神经元损伤的表观遗传机制中，组蛋白乙酰化和去乙酰化因调控细胞存活、抗氧化防御及炎症反应相关基因表达而受到越来越多的关注。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是去除组蛋白和非组蛋白乙酰基的关键酶，导致染色质凝缩和转录抑制。HDAC活性升高与氧化应激诱导的神经元损伤、细胞防御机制受损及凋亡易感性增强相关。相反，去乙酰化酶1（SIRT1）作为NAD⁺依赖性去乙酰化酶，通过促进抗氧化反应、抑制炎症、保护线粒体功能和增强细胞存活发挥保护作用。HDAC活性与SIRT1在细胞应激反应中的相反作用为在抗氧化干预研究中同时考察这两个参数提供了依据。

天然多酚类产物因其保护细胞免受氧化损伤的能力而被广泛研究。其中，桑葚果实是花青素的宝贵来源，特别是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）、矢车菊素-3-O-芸香糖苷（C3R）和锦葵素-3-O-葡萄糖苷（M3G）。然而，花青素的应用受限于其相对较低的稳定性和生物利用度，在加工、储存和消化过程中易降解。磷脂复合物（Phytosome）技术通过植物来源生物活性化合物与磷脂形成复合物来改善其递送，已被证明可增强化合物稳定性、膜通透性和细胞摄取。尽管桑葚花青素的抗氧化和抗炎活性已有研究，但关于以磷脂复合物形式制备的富含花青素的桑葚提取物对氧化应激诱导的神经元损伤的作用证据仍然有限。因此，本研究探讨了桑葚果实提取物磷脂复合物（MAP）对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激和细胞损伤的潜在神经保护活性。

二、主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：桑葚果实（品种：Chiang Mai）采自泰国乌隆他尼府皇后诗丽吉蚕桑中心，选取完全成熟（M7期）果实，经50%乙醇水溶液浸提、减压浓缩和冷冻干燥获得桑葚果实提取物（MAE）。将MAE与磷脂酰胆碱（PC）按不同比例复合制备MAP，通过动态光散射（DLS）测定粒径（PS）、Zeta电位（ZP）和多分散指数（PDI），采用pH示差法测定总花青素含量（TAC），Folin–Ciocalteu法测定总酚含量（TPC），并计算花青素结合效率（AE）。采用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）对C3G和M3G进行定性和定量分析。以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞（ATCC^? CRL-2266?）为体外神经元模型，采用MTT法评估细胞活力，LDH释放实验评估细胞膜损伤，CM-H₂DCFDA荧光探针检测细胞内ROS水平，硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）法测定MDA含量，比色法测定SOD、CAT和GSH-Px活性，荧光法测定HDAC活性，Western blot分析SIRT1、NF-κB、TNF-α、Bcl-2和Bax蛋白表达。此外，利用AutoDock Vina 1.2.0对C3G和M3G与HDAC2、HDAC6、SIRT1、TNF-α、NF-κB、Bcl-2和Bax七个靶蛋白进行分子对接分析。

三、研究结果

3.1 MAP的理化表征

MAE的TPC和TAC分别为135.67 ± 3.50 μg GAE/mg提取物和72.33 ± 2.83 μg C3G当量/mg提取物。不同MAE:PC比例制备的MAP理化性质各异。在50:50配比下，AE为82.96 ± 4.53%，平均粒径为153.80 ± 3.51 nm，ZP绝对值最高（?38.54 ± 0.32 mV），综合理化特征最优，因此该配比被选用于后续生物学研究。

3.2 HPLC分析花青素

所建立的HPLC-DAD方法在C3G和M3G检测中表现出良好的线性、灵敏度、准确度和精密度。MAE中C3G和M3G含量分别为13.15 ± 0.04和38.57 ± 0.05 μg/mg提取物；50:50 MAP中C3G和M3G含量分别为6.72 ± 0.01和17.84 ± 0.02 μg/mg制剂，M3G检出含量高于C3G。

3.3 MAE、PC和MAP无毒浓度的确定

MAE、PC和MAP在浓度≤30 μg/mL时均不显著影响细胞活力。MAE在100 μg/mL时显著降低细胞活力，PC和MAP在300 μg/mL及以上浓度出现显著活力下降。据此选定MAE在3、10、30 μg/mL，PC和MAP在10、30、100 μg/mL作为后续实验的无毒浓度。

3.4 MAE、PC和MAP对细胞活力和LDH释放的影响

H₂O₂暴露显著降低细胞活力并增加LDH释放。MAE在30 μg/mL时显著提高细胞活力并减少LDH释放。PC在所有测试浓度下均未显著改善细胞活力或减少LDH释放。MAP在30和100 μg/mL时显著恢复细胞活力并减少LDH释放，其中30 μg/mL效果最显著。

3.5 MAP对HDAC活性的影响

H₂O₂暴露显著增加HDAC活性。MAE和MAP处理均显著降低HDAC活性，且MAP对HDAC活性的降低作用显著大于MAE。

3.6 MAP对SIRT1表达的影响

H₂O₂暴露显著降低SIRT1表达。MAP处理显著增加SIRT1表达，且显著高于MAE处理组。MAE单独处理未显著改变SIRT1表达。

3.7 MAP对氧化应激标志物的影响

H₂O₂暴露显著增加细胞内ROS产生和MDA水平。MAE和MAP均显著降低ROS和MDA水平，MAP对ROS的降低作用显著强于MAE，但两者对MDA的作用无显著差异。

3.8 MAP对抗氧化酶活性的影响

H₂O₂暴露显著降低SOD、CAT和GSH-Px活性。MAE显著恢复SOD和GSH-Px活性但对CAT无显著作用。MAP显著恢复SOD、CAT和GSH-Px三种酶活性，且对CAT的恢复作用显著强于MAE。

3.9 MAP对炎症介质的影响

H₂O₂暴露显著增加NF-κB和TNF-α表达。MAE和MAP均显著降低NF-κB和TNF-α表达，MAP对TNF-α的降低作用显著强于MAE。

3.10 MAP对凋亡相关蛋白表达的影响

H₂O₂暴露显著增加Bax表达并降低Bcl-2表达。MAE和MAP均显著降低Bax表达并增加Bcl-2表达，两者间无显著差异。

3.11 花青素与靶蛋白的分子对接分析

分子对接分析显示C3G和M3G均能容纳于HDAC2、HDAC6、SIRT1、TNF-α、NF-κB、Bcl-2和Bax的结合口袋中，预测结合分数和相互作用模式因靶蛋白而异。参考配体再对接的RMSD值均低于2.0 ?，验证了对接方案的可靠性。两种化合物与各靶蛋白形成氢键、疏水相互作用和π相关相互作用。

四、讨论与结论总结

研究结果表明，MAP在30 μg/mL浓度下比相同浓度的MAE表现出更强的细胞保护作用，提示磷脂复合物制剂可能改善了提取物的功能可利用性，而非简单增加花青素给药量。MAP在ROS抑制、抗氧化防御恢复、TNF-α减弱以及HDAC活性和SIRT1表达调节方面较MAE更为突出，而在脂质过氧化和凋亡蛋白方面的作用与MAE相当。分子对接结果提供了C3G和M3G与氧化应激、炎症和凋亡相关蛋白潜在相互作用的初步结构学见解。

研究存在以下局限性：体外SH-SY5Y细胞模型不能完全反映体内神经元反应的复杂性；HPLC-DAD未提供全面植物化学分析，基质特异性回收率未直接评估；细胞摄取、花青素稳定性、体内吸收和代谢未评价；HDAC活性和SIRT1表达的变化表明去乙酰化相关反应的调节，但未建立直接的调控关系；分子对接结果需要实验验证。

结论：MAE对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤具有保护作用，MAP制剂增强了该活性的多个方面。MAP的增强反应在ROS抑制、抗氧化防御恢复、TNF-α减弱以及HDAC活性和SIRT1表达调节方面最为明显，而对脂质过氧化和凋亡蛋白的作用与MAE相当。这些发现表明MAP制剂可能在该细胞模型中增强MAE的保护活性，并为MAP作为食物来源生物活性花青素的潜在应用提供了体外证据。有必要在动物模型和最终临床研究中进一步验证MAP的神经保护潜力，确立其体内生物学相关性，并阐明HDAC/SIRT1相关反应是否对观察到的生物学效应具有因果贡献。