《Nutrients》：Effects of Circadian Phase and Exercise Training on Systemic and Tissue-Specific Redox Responses in Mice Fed a High-Fat Diet
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背景： 高脂饮食（HFD）诱导的代谢应激条件下，运动时间对氧化还原适应的影响尚不清楚。本研究探讨了训练所处的昼夜节律相位是否改变HFD喂养小鼠的系统性及组织特异性氧化还原反应。
方法： 雄性C57BL/6J小鼠饲喂HFD后保持久坐，或在授时时间3（ZT3）或授
背景： 高脂饮食（HFD）诱导的代谢应激条件下，运动时间对氧化还原适应的影响尚不清楚。本研究探讨了训练所处的昼夜节律相位是否改变HFD喂养小鼠的系统性及组织特异性氧化还原反应。
方法： 雄性C57BL/6J小鼠饲喂HFD后保持久坐，或在授时时间3（ZT3）或授时时间15（ZT15）进行8周跑台训练。最终训练结束后48小时采集样本。采用OXY-吸附试验（OXY）、活性氧代谢衍生物试验（d-ROMs；主要反映循环氢过氧化物）及生物抗氧化电位试验（BAP）评估血浆氧化还原状态，并在三种骨骼肌和肝脏中定量氧化还原及炎症相关基因的表达水平。
结果： 运动显著提高BAP（p = 0.0442），而OXY无显著变化。相位×运动交互效应对d-ROMs的影响呈非显著性趋势（p = 0.0560）；探索性比较显示，ZT15-久坐（sed）组的d-ROMs高于ZT3-sed组和ZT15-运动（exe）组。腓肠肌（GAS）的Nfe2l2呈名义上的相位×运动交互效应。比目鱼肌（SOL）的Hmox1在ZT15及运动条件下表达更高。股四头肌（QUA）的Nfe2l2在ZT3表达更高，而Cat在ZT15表达更高。肝脏Keap1在ZT15表达更高，尤其在久坐小鼠中，而炎症转录本基本无变化。经假发现率（FDR）校正后，仅SOL Hmox1和肝脏Keap1的相位效应仍具显著性。
结论： 长期运动与更高的血浆铁还原能力相关，且不受昼夜节律相位影响，而组织氧化还原相关转录反应主要与昼夜节律相位相关，并因组织而异。活跃期运动是否较休息期运动具有氧化还原优势仍需进一步研究。
论文解读
一、研究背景与目的
昼夜节律是生物体内约24小时周期的内源性节律，由核心时钟基因的转录-翻译反馈环路产生，调控能量代谢、氧化还原平衡和激素分泌等多项生理过程。运动训练是维持代谢稳态和氧化还原平衡的重要手段，但运动的适应性效应并非恒定不变，而是受运动强度、持续时间及昼夜节律相位等多种因素调节。近年来，运动时间已被认为是影响代谢反应和训练效率的关键时间生物学决定因素。
在分子层面，核心时钟复合物CLOCK-BMAL1不仅驱动时钟基因的节律性表达，还直接调控Nfe2l2等抗氧化基因的转录，将核心时钟与抗氧化防御联系起来。运动诱导的活性氧（ROS）在生理范围内可作为信号分子介导运动适应，激活NRF2信号通路，促进抗氧化酶表达。然而，过量ROS积累则会造成氧化损伤。不同肌纤维类型的骨骼肌中，抗氧化酶活性及其对运动的反应存在差异，提示运动诱导的氧化还原反应可能具有肌肉特异性。
高脂饮食（HFD）喂养会削弱行为和分子层面的昼夜节律，并可通过脂肪酸氧化等途径影响线粒体ROS产生。既往研究多聚焦于急性运动诱导的氧化应激，而长期、特定时间运动训练对系统性氧化还原状态及不同骨骼肌和肝脏中抗氧化和炎症基因表达的影响尚缺乏系统研究。基于此，本研究探讨了在HFD喂养小鼠中，ZT3（早期休息期）和ZT15（早期活动期）进行的长期运动训练是否对系统性及组织特异性氧化还原反应产生差异性影响。
二、研究设计与技术方法
本研究使用此前已报道的队列，包括32只7周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自Takasugi Experimental Animal Supply Co., Ltd.（日本春日部市），适应2周后饲喂HFD（D12492，Research Diets，60 kcal%脂肪）。研究采用2×2析因设计，因素为昼夜节律相位（ZT3或ZT15）和运动条件（久坐或运动）。ZT15组通过24小时持续光照后光暗周期反转实现12小时相位延迟。运动组进行8周渐进性中等至较大强度跑台训练（每周5天，每天60分钟），训练速度为9 m/min起始，第13周起稳定于17.5 m/min。最终样本量为ZT3-sed n=5，ZT3-exe n=8，ZT15-sed n=8，ZT15-exe n=8。
主要技术方法包括：使用FREE分析仪进行OXY-吸附试验（评估血浆中和次氯酸的抗氧化能力）、d-ROMs试验（反映循环氢过氧化物负荷）和BAP试验（评估血浆铁还原能力）；采用定量实时聚合酶链反应（qPCR）检测三种骨骼肌（腓肠肌GAS、比目鱼肌SOL、股四头肌QUA）和肝脏中氧化还原及炎症相关基因的mRNA表达水平；使用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计检验，并采用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）校正。
三、研究结果
3.1 系统性氧化还原状态
血浆OXY在各组间无显著主效应或交互效应。d-ROMs的相位×运动交互效应接近显著（p = 0.0560），探索性事后比较显示ZT15-sed组显著高于ZT3-sed组和ZT15-exe组。BAP存在显著的运动主效应（p = 0.0442），运动组血浆铁还原能力更高，但经FDR校正后未保持显著。
3.2 腓肠肌（GAS）抗氧化及炎症基因表达
GAS中Nfe2l2存在显著的相位×运动交互效应（p = 0.0370），事后分析显示ZT15-sed组表达高于ZT3-sed组，但经FDR校正后不显著。其余抗氧化基因（Hmox1、Sod2、Cat、Gpx1）和炎症基因（Tnf、Il1b、Il6）均无显著差异。
3.3 比目鱼肌（SOL）抗氧化及炎症基因表达
SOL中Hmox1受相位（p = 0.0078）和运动状态（p = 0.0187）双重显著调节，ZT15组和运动组表达更高。经FDR校正后，相位效应仍显著（q = 0.039），运动效应未保持显著。Cat呈非显著性相位效应趋势（p = 0.0692）。
3.4 股四头肌（QUA）抗氧化及炎症基因表达
QUA中Nfe2l2在ZT3表达更高（p = 0.0142），而Cat在ZT15表达更高（p = 0.0476），两者呈相反的相位依赖性表达模式，但均未通过FDR校正。Sod1和Il1b的相位×运动交互效应接近显著，但事后比较无显著配对差异。
3.5 肝脏氧化还原及炎症基因表达
肝脏Keap1存在显著的相位主效应（p = 0.0002）和相位×运动交互效应（p = 0.0350），ZT15-sed组表达显著高于ZT3-sed组。经FDR校正后，相位效应仍显著（q = 0.0015）。Adgre1的交互效应接近显著（p = 0.0700）。Nfe2l2及各炎症基因均无显著差异。
四、讨论与结论
讨论部分总结：
本研究的主要发现是：在HFD喂养小鼠中，昼夜节律相位而非相位特异性运动反应是组织氧化还原相关转录的主要影响因素。系统层面，运动与更高的血浆铁还原能力相关，与相位无关；组织层面，三种骨骼肌和肝脏均观察到相位相关的氧化还原基因差异，其中SOL Hmox1和肝脏Keap1的相位效应最为稳健，而炎症转录本基本无变化。
运动提高BAP评估的血浆铁还原能力，可能反映长期训练通过反复暴露于适度运动诱导的ROS所建立的系统性还原能力增强，NRF2介导的抗氧化信号是可能的贡献机制。d-ROMs的相位×运动交互趋势提示，循环氢过氧化物积累对运动的时间情境更为敏感，ZT15-exe组较ZT15-sed组更低的d-ROMs与活动期久坐条件下较高氧化负荷被运动减轻相一致。
不同肌纤维类型的肌肉呈现不同的相位相关转录模式：氧化型SOL中Hmox1呈相位和运动双重调节；GAS中Nfe2l2的交互效应主要反映静坐组间的相位差异被运动改变；QUA中Nfe2l2和Cat呈相反方向的相位依赖性表达。这种异质性符合肌肉特异性氧化还原景观的概念，提示肌肉代谢表型与昼夜节律相位共同塑造氧化还原相关转录反应。
肝脏中仅Keap1呈显著的相位依赖性调节，ZT15表达更高且在静坐条件下最为明显。KEAP1作为NRF2的负调控因子，其mRNA水平的相位差异提示NRF2信号调控环境存在相位依赖性差异。该相位敏感的Keap1反应发生在具有时间组织性的肝脏代谢环境中，但脂质和氧化还原结果在mRNA水平并未同步变化。
由于C57BL/6J小鼠存在褪黑素合成酶基因缺陷，几乎不产生松果体褪黑素，本研究中观察到的相位相关差异更可能反映由摄食和运动等授时因子夹带的周围组织时钟等非褪黑素依赖机制。
研究结论：
本研究探讨了昼夜节律相位和长期运动训练在HFD条件下对系统性及组织特异性氧化还原反应的影响。运动与更高的血浆铁还原能力相关，且不受昼夜节律相位影响，而OXY评估的次氯酸中和能力无变化。循环氢过氧化物（d-ROMs）仅呈相位×运动交互趋势，探索性比较提示ZT15-sed小鼠水平较高。分子层面，SOL Hmox1在ZT15及运动小鼠中表达更高，QUA中Nfe2l2和Cat呈相反方向的相位差异且无运动效应。GAS（Nfe2l2）和肝脏（Keap1）在ZT15-sed小鼠中表达高于ZT3-sed小鼠，该差异在运动小鼠中不明显。骨骼肌和肝脏的炎症转录本基本无变化。这些探索性发现提示，长期运动与更高的血浆铁还原能力相关，而组织转录反应主要与昼夜节律相位相关并因组织而异。活跃期运动是否较休息期运动产生更有利的氧化还原适应，需使用更多昼夜节律时间点、蛋白质及功能水平测量和雌性动物进一步研究。
