产烟酰胺单核苷酸（NMN）益生菌Ligilactobacillus salivarius B12-N在秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型中减轻衰老与认知衰退：疗效及潜在机制

《Foods》：Nicotinamide Mononucleotide-Producing Probiotic Strain B12-N Attenuates Aging and Cognitive Decline in a Caenorhabditis elegans Model of Alzheimer’s Disease: Efficacy and Underlying Mechanisms

　　

烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide, NMN）是益生菌中发现的一种活性成分，可能有助于缓解阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）和衰老效应。经细菌细胞提取物的LC–MS（liquid chromatography–mass spectrometry，液相色谱–质谱）分析测定，筛选出的产NMN菌株Ligilactobacillus salivarius B12-N含6.25 μg NMN/10⁹ CFU（colony-forming units，菌落形成单位）。结果表明，在趋化行为方面，B12-N较纯化NMN显示出略大的数值改善。然而，在检测的其他AD相关或衰老相关表型中，B12-N与NMN之间未观察到显著差异。转录组分析（transcriptome analysis）显示，NMN组与B12-N组共有16条通路。值得注意的是，P450代谢通路、长寿调控通路和自噬通路显著富集。这些发现表明，对B12-N和NMN的表型与转录组反应存在部分重叠，提示NMN可能参与与B12-N相关的一些生物学效应。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的进行性神经退行性疾病，约占所有痴呆病例的55%至75%。随着全球人口老龄化，AD发病率显著增加，预计2030年AD患者将达到7800万，2050年达到1.39亿，给社会和患者家庭带来沉重负担。近期研究认为可溶性小寡聚体形式的淀粉样β蛋白（amyloid-β, Aβ）是主要神经毒性物质，因此研究重点已从抑制纤维形成转向阻止毒性寡聚中间体形成，以延缓AD发生和缓解症状。益生菌是足量摄入时赋予宿主健康益处的活微生物，可通过维持肠道菌群稳态、降低炎症反应和减轻氧化应激改善AD并缓解认知衰退。益生菌代谢物可能是其发挥有益作用的主要机制，例如短链脂肪酸和吲哚代谢物可增强肠道屏障完整性、参与代谢调节并促进肠–脑轴通讯。烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide, NMN）可减轻AD模型中毒性寡聚体聚集，使NMN、AD与衰老成为当前研究焦点。NMN是一种生物活性核苷酸，在AD模型中可通过增强Aβ清除和恢复自噬功能改善AD症状并延缓衰老。已有研究显示益生菌可产生NMN，但尚需进一步确定其能否有效缓解AD。研究人员因此假设产NMN益生菌株可能对AD相关和衰老相关表型具有有益作用。本研究从中国健康长寿老年人新鲜粪便样本中分离菌株，按产NMN能力分类并筛选高产生菌株，随后利用线虫模型评价该菌株缓解AD和延缓衰老的效果与机制。具体而言，表达人Aβ_1–42的转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）株CL2355作为模型生物，评估高产生NMN菌株和NMN单用的AD缓解与寿命延长效果，并检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平、自噬和年龄相关生理功能，进一步通过转录组分析识别与表型反应可能相关的分子通路。

为开展研究，样本队列来源为中国健康长寿老年人新鲜粪便，研究人员共分离并鉴定633株细菌。关键技术方法包括：基于全基因组测序和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）通路注释分析NMN合成通路；采用荧光衍生法初筛产NMN菌株，并以LC–MS确认和定量NMN；制备NMN含量匹配的Ligilactobacillus salivarius B12-N和纯化NMN干预；使用CL2355、CL2122、BC12921和DA2123线虫株，开展趋化、ThT（Thioflavin T，硫黄素T）染色、ROS、自噬、寿命、咽泵、运动、油红O染色和转录组分析；统计采用Kaplan–Meier生存分析、log-rank检验、单因素方差分析及Tukey多重比较。

3.1 基于基因组数据的益生菌NMN产生通路：依据KEGG数据库map00760通路，研究人员鉴定出三条主要NMN合成通路。通路1为L-Aspartate→Iminoaspartate→Quinolinate→Nicotinate D-ribonucleotide?Deamino-NAD⁺→NAD⁺→NMN，属从头合成；通路2为Rib?R-5-P?PRPP→NMN；通路3为NAD⁺→Nicotinamide?N-Ribosyl-nicotinamide→NMN，通路2和3属补救合成。研究人员以三条反应链最后一步酶对应KO拷贝数非零为核心筛选策略，从菌株库筛选633株，分为54个物种，主要包括214株Lgb. salivarius、87株Limosilactobacillus mucosae、61株Limosilactobacillus fermentum、47株Limosilactobacillus reuteri等。结果显示，本研究中几乎所有乳酸菌主要通过通路1合成NMN，仅少数菌株可通过通路2和3合成NMN。

3.2 产NMN益生菌菌株筛选：从633株候选菌中，经荧光法NMN测定鉴定出116株能够合成NMN。随后依据物种分类、产量潜力、固有发酵性能和进一步开发适用性，选择20株益生菌进行LC–MS定量，包括8株Lgb. salivarius、6株Lcb. paracasei和6株Lpb. plantarum。结果显示，Limosilactobacillus salivarius的胞内NMN积累水平显著高于其他受试菌株，其中B12-N菌株NMN含量最高，为6.25 μg/10⁹ CFU。因此，Lgb. salivarius B12-N被选为高NMN产生益生菌用于后续实验，并设置与10⁹ CFU B12-N实测NMN含量（6.25 μg）匹配的纯化NMN参考处理。低NMN产生菌株Lgb. salivarius B135U作为负对照，用于趋化实验和自噬水平检测。

3.3 NMN和益生菌改善AD线虫模型中的Aβ相关行为功能障碍
3.3.1 NMN和益生菌改善C. elegans CL2355趋化缺陷：CL2355是神经元细胞表达Aβ的转基因线虫模型。研究人员通过温控转换建立趋化损伤模型，发现CL2355线虫趋化指数（chemotaxis index, CI）较CL2122线虫显著降低，证明趋化行为明显下降，模型建立成功。NMN和B12-N处理组CI较未处理对照组显著升高，表明对气味剂苯甲醛的趋化性显著增强。其中，B12-N处理线虫趋化增强最显著，超过单独NMN处理（p<0.01）；B135U趋化改善显著低于B12-N。由于B12-N中NMN含量与NMN干预组相当，研究人员认为B12-N的神经保护作用及其缓解趋化缺陷的能力在一定程度上与NMN相关，同时该细菌还含有其他神经保护化合物。

3.3.2 NMN和B12-N降低C. elegans CL2355中Aβ相关淀粉样聚集体和ROS水平：研究人员定量CL2355头部Aβ相关淀粉样聚集体，发现CL2355中存在Aβ相关淀粉样聚集体，而NMN和B12-N组CL2355头部Aβ相关淀粉样聚集体数量显著减少（p<0.01）。尽管B12-N组Aβ相关淀粉样聚集体最低，但与NMN组比较无显著差异（p>0.05）。氧化应激与Aβ毒性和AD相关病理密切相关。研究人员检测CL2355线虫ROS水平，发现NMN和B12-N处理组ROS水平显著降低（p<0.01）。与Aβ相关淀粉样聚集体模式一致，B12-N处理组ROS数值最低，但B12-N与NMN组差异无统计学显著性（p>0.05）。

3.3.3 NMN和益生菌调节C. elegans DA2123和BC12921自噬相关活性：自噬受损是AD关键特征并加重其进展。研究人员利用表达SQSTM1/p62融合蛋白作为自噬标志物的BC12921模型，发现NMN和B12-N处理显著降低BC12921线虫头部SQST-1::GFP积累（p<0.01），两处理组间无显著差异；B135U组未观察到显著下降。由于SQST-1/p62是经自噬–溶酶体途径降解的自噬底物，其积累减少通常与自噬降解增强一致，因此提示NMN和B12-N可能调节自噬相关活性并促进自噬底物清除。DA2123株表达由lgg-1启动子驱动的LGG-1::GFP融合蛋白。自噬过程中LGG-1::GFP重新分布并定位于代表前自噬体和自噬体组分的点状结构。结果显示，NMN和B12-N处理DA2123线虫缝细胞中LGG-1::GFP斑点数量显著增加（p<0.01），B135U组无显著增加；B12-N与NMN组间增加程度相当，无统计学显著差异。综合LGG-1::GFP斑点增加和SQST-1::GFP积累减少，提示NMN和B12-N处理与线虫自噬活性增强一致。

3.4 NMN和益生菌缓解C. elegans CL2355衰老特征
3.4.1 NMN和益生菌延长C. elegans CL2355寿命：研究人员检测NMN和益生菌补充对线虫寿命的影响，发现NMN和B12-N显著延长CL2355线虫平均寿命。NMN组平均寿命为22.64天，较对照组21.88天增加3.5%；B12-N组平均寿命延长至24.34天，增加11.2%。

3.4.2 NMN和B12-N改善CL2355咽泵和年龄相关功能表型：咽泵速率是线虫健康的重要指标。第12天，各组咽泵频率无显著差异，提示补充剂未显著影响摄食、摄食偏好或干扰咽泵速率。到第20天，模型组CL2355线虫咽泵速率降至平均20次/分钟；NMN和B12-N组分别维持86和85次/分钟，较对照组增加331%和325%。这表明NMN和B12-N减轻CL2355线虫年龄相关的咽泵下降。研究人员还评估成虫第12、16、20和24天运动能力，发现运动类别分布随年龄向低活动类别偏移；第16和20天，NMN和B12-N处理组更多线虫保持在A类，提示NMN和益生菌可能减轻CL2355线虫年龄相关运动功能下降。脂质稳态与C. elegans衰老和长寿密切相关。油红O染色显示，B12-N处理显著降低脂质积累（p<0.01），提示B12-N延长寿命的作用伴随年龄相关脂质稳态改善。总体表明，B12-N和等量NMN可延缓CL2355线虫衰老相关表型，从而增加平均寿命。

3.5 NMN和B12-N处理对CL2355菌株转录谱的影响：干预第5天，对照组、NMN组和B12-N组CL2355经M9缓冲液冲洗后进行转录组分析。NMN组和B12-N组分别有917和2196个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）；NMN组中539个上调、378个下调，B12-N组中1153个上调、1043个下调。因此，B12-N处理在检测条件下较NMN处理引起更广泛的转录组反应。KEGG通路富集分析显示，NMN组和B12-N组前20条富集通路中有16条共享，表明两者转录组反应部分重叠。值得注意的是，P450代谢通路、长寿调控通路和自噬通路显著富集，分别富集37、23和22个基因。对这三个通路基因进行聚类分析，并基于已有文献选择5个代表性基因进一步分析：P450代谢通路中参与氧化应激和解毒的gst-26在NMN和B12-N干预后显著上调（p<0.01），两处理间无显著差异（p>0.05）；长寿调控通路中与寿命负相关的daf-2和daf-9在B12-N和NMN干预后显著下调（p<0.05），两处理间无显著差异（p>0.05）；自噬通路中参与自噬过程中蛋白降解和加工的asp-12和asp-13在B12-N和NMN干预后显著上调（p<0.05），其中asp-13上调在B12-N组显著高于NMN组（p<0.05）。

讨论部分指出，AD是最普遍的神经退行性疾病，与衰老密切相关。AD的关键代谢改变是年龄相关NAD⁺（nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）下降，而NAD⁺耗竭与Aβ相关淀粉样聚集体和线粒体功能障碍等核心AD病理相关。外源性NMN补充可提升NAD⁺水平并缓解年龄相关衰退，但临床应用受低生物利用度和高成本限制。因此，天然微生物来源，尤其乳酸菌，作为持续原位生产NMN的活体生物治疗工厂，在AD背景下仍未被充分探索。研究人员通过基因组通路分析、荧光筛选和LC–MS分析筛选633株候选菌，鉴定出产NMN菌株Lgb. salivarius B12-N，其细胞相关NMN含量为6.25 μg/10⁹ CFU。随后在表达人Aβ_1–42的转基因C. elegans AD模型中，以B12-N和含量匹配NMN作为干预。研究显示，口服B12-N显著延长平均寿命并改善Aβ诱导的行为缺陷，这些有益作用与自噬增强、氧化应激降低和Aβ相关淀粉样聚集体抑制相关。讨论进一步分析P450代谢轴、长寿调控网络和自噬过程等关键信号级联。关于NMN产生，已有研究提示乳酸菌具有天然合成NMN的能力；本研究中几乎所有乳酸菌主要经从头合成通路合成NMN，并通过荧光法和LC–MS筛选出Lgb. salivarius高积累菌株。关于益生菌缓解AD和延缓衰老，NMN与B12-N缓解趋化缺陷和衰老迹象之间存在一定关联。转录组分析显示NMN和B12-N前20条富集通路中有16条共享，P450代谢、长寿调控和自噬通路显著富集。增强自噬活性可延缓衰老并加速Aβ和tau清除，从而缓解衰老和AD相关病理与症状。本研究中NMN和益生菌显著降低SQST-1::GFP积累并增加LGG-1::GFP斑点，提示调节自噬相关过程并可能反映自噬活性增强。asp-12和asp-13编码天冬氨酸蛋白酶，属溶酶体蛋白酶家族，参与蛋白降解、溶酶体功能和自噬流调节；其上调可增强错误折叠蛋白清除、维持蛋白稳态并缓解神经毒性。P450指细胞色素P450酶家族，主要参与外源物质代谢、解毒和内源化合物合成；gst-9和gst-26具有抗氧化、解毒和亲电物质清除功能。daf-2编码胰岛素/IGF-1受体，降低DAF-2信号可促进下游DAF-16/FOXO转录因子核激活并增强应激抵抗和长寿相关基因表达；daf-9编码特定CYP酶（CYP22A1），参与dafachronic acid类固醇激素合成，调节DAF-12核受体活性并影响发育、应激抵抗和寿命。讨论也强调，尽管B12-N具有高NMN产生能力且纯化NMN显示相似保护表型，但当前实验设计不能证明NMN是B12-N有益作用的特定或唯一介导因素。研究人员未能通过破坏NMN生物合成相关基因生成完全NMN缺陷的B12-N衍生物；低NMN产生菌株B135U在趋化和自噬实验中与模型组无显著差异，但与B12-N组有显著差异；由于菌株间代谢差异，无法用某些低NMN产生菌株作为负对照来证明B12-N效应主要归因于NMN。因此，研究结果支持NMN是B12-N保护作用的潜在贡献因素，而非确立其为唯一因果介导因素。未来研究应使用NMN生物合成能力被基因敲除的同源B12-N衍生物，直接确定细菌产生NMN的因果作用。此外，B12-N虽含大量NMN，但NMN从摄入细菌细胞释放、保持稳定并可供宿主利用的程度尚未确定；未来需直接定量线虫肠道内容物或全身提取物中的NMN，并测定喂养过程中B12-N的NMN释放。

研究结论翻译：总之，NMN和B12-N在转基因C. elegans CL2355模型中缓解了若干AD相关和衰老相关表型。转录组分析显示，两种干预后P450代谢、长寿调控和自噬相关通路发生部分重叠变化。结合观察到的自噬相关表型、ThT阳性Aβ相关淀粉样聚集体负荷、ROS水平、认知功能和寿命改善，这些发现提示NMN和B12-N可能影响与AD相关病理和衰老相关的多个生物学过程。