《Foods》：Biodiversity, Survival, and Influence on Quality of Yeast Biota in Virgin Olive Oil
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特级初榨橄榄油(EVOO)的微生物稳定性和感官品质在很大程度上取决于其储存期间油载酵母生物群(oil-borne yeast biota)的活性。初榨橄榄油(VOO)在其水微相(aqueous microphase)中栖息着低丰度的酵母生物群，而细菌和霉菌通常
特级初榨橄榄油(EVOO)的微生物稳定性和感官品质在很大程度上取决于其储存期间油载酵母生物群(oil-borne yeast biota)的活性。初榨橄榄油(VOO)在其水微相(aqueous microphase)中栖息着低丰度的酵母生物群，而细菌和霉菌通常因低水分活度和高酚类含量而受到抑制。念珠菌属(Candida, 6种)、山田酵母属(Yamadazyma, 5种)、酒香酵母属(Brettanomyces, 2种)、Kuraishia属(2种)、Nakazawaea属(2种)和Ogataea属(2种)为主导类群，占已报道酵母多样性的70%。酵母的存活受水分含量、氧气和酚类浓度的强烈影响，除非存在游离水，否则种群数量随时间推移而下降。酵母代谢活性可能产生有害或有益的影响：产脂肪酶菌种(如Candida adriatica、Yamadazyma terventina)会增加游离酸度和氧化敏感性，导致感官缺陷，而橄榄苦苷分解酵母(oleuropeinolytic yeasts)则通过β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)和酯酶(esterase)介导的橄榄苦苷水解作用降低苦味。由于欧盟法规禁止使用添加剂和起始培养物，控制工艺参数(如调配和倾析)仍是唯一可靠的策略。正如Don Carlo和Coratina品种的试验所证实，对内源酵母的选择性管理成功地在特级初榨橄榄油法定限度内减轻了苦味，同时保持了品质参数，从而在感官特征、货架期和商业价值之间实现了平衡。
1. 引言
初榨橄榄油(VOO)是通过橄榄果实的机械提取获得且无需后续精炼即可食用的油脂，是地中海国家的主要膳食脂肪。其特殊的化学组成——抗氧化化合物和不饱和脂肪酸含量高——是该油脂备受关注的原因。新生产的VOO因含有植被水微滴以及被水膜包裹的橄榄果肉和果皮固体颗粒而呈现浑浊状态，这些构成了VOO的悬浮部分。储存期间，悬浮部分沉降并在容器底部形成沉积物。工业生产中常采用棉滤器和纤维素压滤机进行过滤，但过滤会降低酚类含量和酵母载量，对氧化稳定性和微生物稳定性产生不同影响。VOO的化学组成中，皂化部分占98%，不皂化部分占2%，后者包含超过230种化合物，其中极性酚类化合物包括酚酸、酚醇、裂环烯醚萜苷、木脂素和黄酮类，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌和抗病毒活性。Ciafardini和Zullo首次证明新生产的VOO中存在由酵母、细菌和霉菌组成的生物群，该生物群在制油过程中定殖于油的悬浮物质。先前综述建立了理解VOO微生物群的基础框架，而近六年发生了重大范式转变，本更新稿件超越了当时的分类学认知，批判性地审视了新鉴定的菌种，如Novakomyces olei、Rasporella oleae和Yamadazyma oleae。此外，研究通过生物技术视角评估了现代工业过滤方法和选择性自然倾析的不同影响，为无需化学添加剂即可商业化生产高苦味特级初榨橄榄油(EVOO)提供了新方案，并报道了酚类特征调控酵母动态的新证据。
2. VOO的微生物群
附着在树上的健康橄榄的油相不含微生物。在制油过程中，油相被来自磨机设备和橄榄果圈(carposphere)的微生物定殖。新生产的VOO微生物群包括酵母、细菌和霉菌，但在储存期间，细菌和霉菌因低水分活度和高酚类含量而在短时间内消亡，酵母则存活并构成储存期间的优势微生物群。
2.1 酵母生物多样性与分布
目前关于橄榄油酵母生物群的知识包括归属于14个属的27种酵母，均通过D1/D2 26S rDNA测序鉴定。念珠菌属(6种)、山田酵母属(5种)、酒香酵母属(2种)、Kuraishia属(2种)、Nakazawaea属(2种)和Ogataea属(2种)为主导类群，占已报道酵母多样性的70%。值得注意的是，其中10个物种是从橄榄油环境中描述的新种，包括Brettanomyces acidodurans、Candida adriatica、Kuraishia mediterranea、Nakazawaea molendinolei、Novakomyces olei、Ogataea histrianica、Ogataea kolombanensis、Rasporella oleae、Yamadazyma oleae和Yamadazyma terventina，表明VOO代表了一个可能驱动物种形成的选择性生态位。从VOO样品中分离的酵母物种中37%为新种。地理上，意大利记录到23种，生物多样性最高，其次是斯洛文尼亚和西班牙。在腐败酵母中，B. acidodurans因其耐酸性以及在油-水界面生长的能力而尤为重要，该菌在此处从羟基肉桂酸产生4-乙基苯酚，并释放胞外脂肪酶以增加游离酸度，这些活动导致了国际橄榄理事会(IOC)认可的"酚类-药味"、"酒味-醋味"和"霉味/泥土味"感官缺陷。
2.2 酵母在VOO中的存活
VOO中酵母的浓度取决于过滤、沉淀和理化组成等因素。一般而言，过滤降低初始微生物载量，但在某些情况下，初始酵母浓度可通过储存期间的细胞复制得到部分或完全恢复。Zullo等人深入研究了棉滤器和纤维素压滤机过滤对新鲜生产的两种单一品种VOO(Coratina和Nera di Colletorto)生物和非生物组分的影响。过滤显著降低了初始酵母浓度，未过滤对照样品的初始酵母计数约为2 log CFU/mL，棉滤器过滤将酵母载量降至1.0至1.4 log CFU/mL之间，视品种而定，而纤维素压滤机的使用导致更剧烈的减少。值得注意的是，经纤维素压滤机过滤后存活的酵母在储存一个月后完全无法存活，这可能是因为过滤油中的水分含量过低，仅为0.06%。在未过滤的VOO中，新生产时的酵母计数为4.56 log CFU/mL，储存一年后为3.03 log CFU/mL。酵母在油相中的存活取决于水分含量、水分活度和VOO的化学组成。VOO的水分含量在0.15%至0.36%(w/w)之间，对应的水分活度约为0.95至0.98，但水分含量超过0.25%(w/w)不仅有利于微生物生长，同时激活了有害于VOO品质的酶。高酚类含量缩短了某些机会致病酵母在VOO中的存活时间，且酵母存活水平具有菌株和酚类含量依赖性。VOO中的脂肪酸和甘油三酯也可抑制酵母生长，游离脂肪酸对酵母细胞膜的破坏被认为是抑制机制。单一品种VOO的调配是调节酵母储存存活的另一关键因素，调配配方中的活酵母计数下降比其单一品种前体更为显著。此外，担子菌类属如隐球菌属(Cryptococcus)、红酵母属(Rhodotorula)和Sporobolus属通常栖息于橄榄果圈和叶片，但在后续储存阶段无法在油基质中持续存在。
2.3 细菌和霉菌
对细菌部分的调查在储存一年的调配油中鉴定出Stenotrophomonas rhizophila、Pseudomonas cedrina、Pseudomonas stutzeri和Pantoea septica等类群。某些P. septica菌株在油中的持续存在得益于其类胡萝卜素和生物乳化剂的合成。通过富集培养，从不同的意大利单一品种油中还回收了芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、库克菌属(Kocuria)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)以及各种乳酸菌(LAB)。酚类浓度也决定细菌的存活能力，大肠杆菌(Escherichia coli)在高酚油中15天内完全失活，但在低酚基质中迅速增殖。来自健康橄榄的VOO中霉菌含量较低，分离的霉菌大多属于曲霉属(Aspergillus)，曲霉属和青霉属(Penicillium)物种已知可产生水解橄榄油甘油三酯的胞外脂肪酶。
3. 酵母对EVOO品质的影响
油载酵母在EVOO储存期间的作用是双重的，取决于酵母种类和油的理化组成。酵母既可能导致品质劣化，也可能促进品质改善。负面效应主要与感官缺陷的发展和化学变化有关。用六株油载酵母菌株(属于C. adriatica、C. diddensiae和N. wickerhamii)接种Leccino EVOO，储存四个月后出现了感官缺陷，如接种C. adriatica菌株1933、N. wickerhamii菌株1885以及C. diddensiae菌株1912和1913的橄榄油出现"泥浆-沉积物"和"哈败"缺陷；而接种C. diddensiae菌株1918和1922的橄榄油无缺陷且保持在EVOO等级，表明储存期间橄榄油感官缺陷的出现具有菌株依赖性。用特定本土酵母菌株(N. wickerhamii、N. molendinolei和Y. terventina)实验性接种导致异味挥发性标志物的显著积累，同时与理想感官属性相关的C6挥发性羰基化合物显著减少。某些酵母类群在储存期间合成胞外脂肪酶(甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)，这些酶裂解甘油三酯的酰酯键，释放游离脂肪酸，从根本上降低氧化稳定性并加速自氧化过程。脂肪分解活性受水相和有机相比率以及总极性酚含量的影响。新鲜VOO的苦味源于一种名为橄榄苦苷的糖苷，储存期间部分酵母通过产生β-葡萄糖苷酶和酯酶水解橄榄苦苷及其衍生物橄榄苦苷苷元，生成无苦味的裂环烯醚酸、羟基酪醇和葡萄糖。
生物-非生物相互作用的批判性评价
对现有文献的批判性分析揭示了VOO非生物基质与酵母代谢行为之间复杂且有时矛盾的关系。高酚类浓度被普遍认为是降低酵母总体存活率的抗菌屏障，但同时也施加了有利于特定强壮菌株存活的严格选择压力。高多酚油并不会变得无菌，而是栖息着高度特化的橄榄苦苷分解或脂肪分解群落。从生态学角度看，这种选择提示了一种共进化适应。橄榄苦苷分解酵母主动产生β-葡萄糖苷酶和酯酶，将苦味糖苷橄榄苦苷水解为无苦味衍生物。这一酶促途径不仅驱动了油的自然脱苦，还通过释放的羟基酪醇调节化学微环境，进一步保持氧化稳定性并延长基质的化学货架期。新鲜提取、未过滤的VOO以瞬时乳液形式存在，植被水微滴和固体颗粒悬浮在连续的甘油三酯基质中。该水微相同时浓缩了极性酚类化合物和酵母定殖与增殖所需的溶解营养物质。然而，由于自然倾析和聚结，该乳液的物理稳定性随时间发生剧烈变化，形成底部沉积层。随着水分含量变化，局部水分活度(aw)波动会触发相反的生化途径。脂肪分解菌种如Candida adriatica或Yamadazyma terventina介导的脂肪分解活性裂解甘油三酯的酰酯键，将游离脂肪酸(FFAs)释放到局部微环境中。从脂质化学角度看，这些FFA的积累不仅增加了可滴定酸度，还从根本上改变了初榨橄榄油基质的自氧化动力学。FFA由于其两亲性质而充当强效促氧化剂，其亲水性羧基优先排列在油微乳液的有机-水界面——即内源酵母和悬浮植被水所占据的确切空间生态位。在该界面，FFA加速自由基链反应的引发和增殖步骤，形成氢过氧化物(初级氧化产物)，随后通过β-断裂反应转化为低分子量挥发性次级氧化产物，主要为直链饱和及不饱和醛类(如己醛、反式-2-庚烯醛)和酮类(如2-辛酮)，这些分子具有极低的气味阈值，是IOC认可的"哈败"和"泥浆-沉积物"感官缺陷的直接化学载体。高度脂肪分解酵母菌株的存在诱导经典化学氧化指标在储存期间发生不同的动态演变。过氧化值(PV)呈现非线性趋势，在严重污染的油中可能最初趋于平稳甚至下降，因为FFA介导的氢过氧化物分解速率超过其形成速率。光谱紫外吸光度提供更可靠的动力学轨迹：k232值选择性测量氢过氧化物初始重排期间形成的共轭二烯，跟踪自由基增殖的早期阶段；k270值测量共轭三烯和次级羰基化合物，显示逐渐且急剧的上升轨迹。在活跃的微生物腐败下，β-断裂途径的加速导致k270在初级自氧化标志物提示严重降解之前很久就已超越特级初榨橄榄油等级规定的严格法定限值。矛盾的是，积累的FFA作为强效两亲性表面活性剂可破坏酵母细胞膜，导致细胞内损伤和活细胞计数下降，这形成了一个自限性但高度破坏性的动力学循环，其中酶促腐败直接损害了其自身生物来源的存活。在工业大容量不锈钢储罐中，微氧化、垂直温度梯度和局部水分活度波动等非生物参数极大地改变了常驻酵母生物群的表型表达，经常将其操作角色从改善品质的生物催化剂转变为主动腐败剂。散装储存期间底部沉积层的形成将细胞集中在油-水界面，形成可能触发有害代谢转变的局部区域，通用型或腐败型菌种如Brettanomyces acidodurans可能在与特化菌株的竞争中胜出，以理想挥发性化合物的损失为代价加速异味挥发性标志物(如4-乙基苯酚、乙酸和短链脂肪酸)的合成。
4. 高苦味EVOO的脱苦生物技术
某些单一品种特级初榨橄榄油(EVOO)，特别是从Don Carlo和Coratina等特定品种提取的油，在机械提取后经常表现出强烈的刺激性苦味，这与极高浓度的极性酚类化合物密切相关。虽然这些高多酚特征具有技术和营养上的高度期望价值，但由此产生的苦味往往超过消费者偏好的阈值。传统工业实践长期依赖保守的物理缓解策略，主要是将这些高苦味批次与较温和的低多酚EVOO进行策略性调配。然而这种方法仅稀释而非转化这些化合物。相比之下，利用内源油载橄榄苦苷分解酵母代谢潜能的目标性生物技术方法提供了一种可持续、无化学添加剂的范式来调节感官特征。一项开创性策略涉及受控生物调配，将高苦味单一品种Don Carlo EVOO与较温和的单一品种Leccino EVOO混合，后者作为富含活性内源橄榄苦苷分解酵母菌株的天然载体。在详细研究中，制备了24个装有5 L EVOO的气密商业金属罐，测试条件包括：(1) Don Carlo EVOO与20%沉降Leccino EVOO混合；(2) Don Carlo EVOO与20%倾析器Leccino EVOO混合；(3) 纯Don Carlo EVOO(对照)。每组在15–16°C下储存3个月，部分罐体每7天倒置一次以防止悬浮物质沉降。常驻酵母生物群在水微相中合成并释放胞外和胞内β-葡萄糖苷酶和酯酶，系统性地裂解苦味裂环烯醚萜苷的糖苷键。在整个生物脱苦动力学窗口内，所有核心理化、品质和纯度指标如游离脂肪酸度、过氧化值和光谱紫外指数(k232、k270和Δk)均严格保持在欧盟法规为优质"特级初榨"商业等级设定的严格法定限值内。该生物方法需要法规取舍，因为所得油在法律上丧失单一品种名称资格，必须作为EVOO混合物销售。为规避商业标签上丧失单一品种状态的法律限制，另一种生物技术策略利用散装储存期间的自然选择性倾析。该过程对以强烈苦味和辛辣感官特征著称的单一品种Coratina EVOO高度有效。研究确定，在15–16°C下于200-L工业不锈钢罐中储存新鲜提取的未过滤Coratina油3个月，可诱导显著的自限性生物脱苦现象。随着特化酵母增殖并代谢悬浮微滴，其水解酶将苦味感知水平逐步降低33%，经独立感官小组重复确认具有统计学显著差异。3个月沉积物接触阶段后，油经过标准工业过滤以去除沉降的酵母生物量和残余水，有效稳定基质。由于未引入外部油或添加剂，最终产品完全保持其作为单一品种Coratina EVOO的高度可销售状态，同时呈现出平衡的、消费者友好的感官特征。这些生物技术干预的工业可扩展性在很大程度上取决于精确的过程监控。生物调配和选择性倾析的成功均依赖于维持生物-非生物交叉对话的严格平衡。水分含量充足(高于0.25% w/w)是维持酵母活力和酶功能的热力学必要条件，但过量水分或长时间沉积物暴露可能引发有害的代谢转变。未来的工程解决方案包括实施非破坏性实时传感器以追踪大型工业储罐中的水分活度和垂直温度梯度。欧盟法规严格禁止使用外源起始培养物或化学防腐剂，风险管理完全依赖于预防性筛选和过程控制。原料分选是首要质量关卡，受严重碰伤或橄榄实蝇(Bactrocera oleae)侵害的橄榄批次必须排除在长期倾析之外，因为它们被B. acidodurans等通用型腐败酵母重度定殖。使用高通量分子工具(如针对特定脂肪分解标志物的qPCR检测)或快速荧光脂肪酶活性测试对新提取的浑浊油进行快速筛选，可在数小时内提供早期微生物概况。如果批次显示出C. adriatica等危险脂肪分解菌种的高初始密度，则必须中止自发倾析策略，立即将该批次导至高效率纤维素压滤机过滤，将水分基线降至0.06%可从根本上破坏酵母细胞膜稳定性并在30天内停止所有潜在腐败动力学。相反，对于进行倾析的合规批次，实时挥发性监测允许生产者确定确切的动力学转折点，在感官缺陷出现之前及时进行排渣和过滤以分离沉积物。
5. 结论、研究差距与局限性
VOO酵母生物群的研究已从基础分离过渡到目标性技术应用，但在工业放大完全实现之前，仍存在若干关键局限和研究差距。方法学局限：当前VOO微生物学的主要局限是历史上依赖培养依赖的分离技术。尽管D1/D2 26S rDNA测序已成功鉴定27个不同物种，但培养依赖的工作流程固有地忽略了活但不可培养(VBNC)的微生物部分。已确定的研究差距：首先，调节二形酵母中胞外脂肪酶与β-葡萄糖苷酶合成的精确分子触发因素在很大程度上仍然未知。其次，尽管调配和倾析已在实验室或小试规模被证明有效，但明显缺乏预测酵母动力学降解或存活以放大到超过10,000 L的工业不锈钢储罐的数学模型。最后，优势酵母生物群与低丰度细菌类群之间的相互作用是一个完全未开发的领域。未来展望：未来研究必须优先整合多组学方法(宏基因组学、宏转录组学和挥发组学)以实时绘制油载微生物群的功能机制。近期研究重点必须集中于在超过10,000 L的大型工业储罐中进行放大验证试验。开发非破坏性、基于传感器的监测工具必须具体瞄准实时追踪高于临界0.25% w/w阈值的水分活度(aw)以及垂直温度梯度的控制(理想维持于15–16°C)。最终，释放这些内源、生态位适应酵母的基因组潜力将为橄榄油工业提供符合严格国际法规框架的生物催化解决方案，优化感官优质性和商业寿命。
